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高温淀粉酶的作用机理、应用领域和使用条件简介 - 知乎
高温淀粉酶的作用机理、应用领域和使用条件简介 - 知乎首发于生物酶知识与运用切换模式写文章登录/注册高温淀粉酶的作用机理、应用领域和使用条件简介南宁车服高温a-淀粉酶采用地衣芽孢杆菌经发酵、提取精制而成。能在较高的温度下迅速水解淀粉分子中α-1.4葡萄糖苷键,任意切断成长短不一的短链糊精和少量的低聚糖,从而使淀粉的粘度迅速下降。液化作用时间延长,还会产生少量的葡萄糖和麦芽糖。本品具有良好的耐高温特性。应用领域:本产品广泛应用于淀粉糖(葡萄糖、饴糖、糊精、果糖、低聚糖)、酒精、啤酒、味精、食品酿造、有机酸、纺织、印染、造纸及其他发酵工业等。应用方法: 1、在啤酒酿造过程中,待辅料与水混合均匀后,以每吨辅料加该酶0.3升左右(2万u/m),可一次加入,迅速升温,在95-97℃,保温30分钟左右。2、在酒精生产中,以每吨原料加入该产品0.3升左右(2万u/ml),PH6.5-7.0,搅匀后用泵送入蒸煮锅或连续蒸煮加热器,温度可控制在100±5℃,时间为100分钟,冷却后糖化。3、在味精、淀粉糖行业应用时,调整PH至6.0-6.5,以毎吨原料添加该酶0.6升(2万u/ml)左右。如采用间隔液化,在液化罐中可迅速升温至100±5℃在95-100℃保温30分钟以上;如采用喷射液化,喷射温度可在105℃左右,并在95℃保温60-120分钟。产品特点: 1、温度范围:最适作用温度在90℃以上,95-97℃液化迅速,100℃仍保持相当的活力,在喷射液化时,瞬间温度可达105-110℃。2、PH范围:有效PH范围在5.5—8.0,最适PH范围在6.0~6.5。3、钙离子对醇活的影响:本品对Ca2要求不高,淀粉水解推荐加入50-70ppm即可。产品性状 :1、产品规格:10万u/g。2、醇活力定义:1g酶液在70℃,PH6.0条件下,1分钟液化可溶性淀粉的毫克数。3、产品标准:执行中华人民共和国行业标進QB/T2306-97。使用条件:最适温度:95℃~97℃,最适pH:6.0~6.5,酶的最适添加量必须按照具体生产情况而定,详情请来函或来电咨询。储存:酶制剂在不同贮存温度下,其活力会随时间不同程度地逐渐失去,建议贮存在阴凉干燥的环境下,应在低温条件下避光保存;贮藏过久或贮藏条件不利,如温度湿度过高,则需要在使用时适量的增大添加量。安全: 耐高温a-淀粉酶属于纯天然的酶制剂,是蛋白质,食用使用酶制剂的食品如同食用含有蛋白质类食物一般,对人体有益无害;对于部分敏感人群,如直接摄入高浓缩的酶粉或雾滴,有可能引起过敏,过长时间接触有可能刺激皮肤、眼睛和粘膜组织; 在操作过程中建议配戴口罩、眼罩等防护用具,剩余或洒出的酶粉需及时处理,对于大量洒出的酶粉应轻轻扫回容器,少量则用真空吸走或用水浸湿清理。中温淀粉酶是一种生物活性物质,易受重金属离子(Fe3+、Cu2+、Hg+、Pb+等)和氧化剂的抑制及破坏作用,在贮存或使用过程中应避免与之接触。包装:铝塑袋包装,1kg×10包/箱;1kg×20包/箱发布于 2022-03-21 17:20淀粉果酒酿造(书籍)淀粉糖绿色精益制造:新产品、新技术、新应用(书籍)赞同添加评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录生物酶知识与运用一个专业介绍生物酶制剂的知识以及应用
α淀粉酶_百度百科
_百度百科 网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心α淀粉酶播报讨论上传视频化学物质收藏查看我的收藏0有用+10本词条由“科普中国”科学百科词条编写与应用工作项目 审核 。α-淀粉酶,系统名称为1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶,别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1,4-糊精酶。黄褐色固体粉末或黄褐色至深褐色液体,含水量5%~8%。溶于水,不溶于乙醇或乙醚。FAO/WHO规定,ADI无特殊限制 [1]。中文名α-淀粉酶外文名α-Amylase;1,4-α-D-Glucan-glucanohydrolase别 名液化型糖化酶;液化淀粉酶;alpha-淀粉酶CAS登录号9000-90-2EINECS登录号232-565-6水溶性溶于水和稀缓冲溶液,几乎不溶于乙醇。外 观黄棕色,冻干粉末目录1基本信息2性质3功能作用4毒理学依据5应用基本信息播报编辑英文名称:α-Amylase(Bacilus subtilis) ;1,4-α-D-Glucan-glucanohydrolase其他名称:中温淀粉酶;液化型淀粉酶;液化酶;α-1,4糊精酶;细菌性淀粉酶;α-淀粉酵素;糊精化酶 [2]CAS号:9000-90-2级别:BioChemika活力:≥50U/mg活力定义:1 U corresponds to the amount of enzyme which liberates 1 μmole maltose per minute at pH 6.9 at 25 °C (starch acc. to Zulkowsky, Catalog No. 85642, as substrate).性状:黄褐色或类白色粉末。由枯草杆菌提取用途:生化研究。能使淀粉迅速液化而生成低分子。 [3]保存:2~8℃性质播报编辑在高浓度淀粉保护下α-淀粉酶的耐热性很强,在适量的钙盐和食盐存在下,pH值为5.3~7.0时,温度提高到93~95℃仍能保持足够高的活性。为便于保存,常加入适量的碳酸钙等作为抗结剂防止结块。α-淀粉酶可以水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键,水解产物为糊精、低聚糖和单糖,酶作用后可使糊化淀粉的黏度迅速降低,变成液化淀粉,故又称为液化淀粉酶、液化酶、α-1,4-糊精酶。α-淀粉酶以链淀粉为底物时,反应一般按两阶段进行。首先,链淀粉快速地降解,产生低聚糖,此阶段链淀粉的黏度及与碘发生呈色反应的能力迅速下降。第二阶段的反应比第一阶段慢很多,包括低聚糖缓慢水解生成最终产物葡萄糖和麦芽糖。α-淀粉酶作用于支淀粉时产生葡萄糖、麦芽糖和一系列限制糊精(由4个或更多个葡萄糖基构成低聚糖),后者都含有α-1,6-糖苷键。α-淀粉酶分子中含有一个结合得相当牢固的钙离子,这个钙离子不直接参与酶-底物络合物的形成,其功能是保持酶的结构,使酶具有最大的稳定性和最高的活性。α-淀粉酶依来源不同最适pH值在4.5~7.0之间,从人类唾液和猪胰得到的α-淀粉酶的最适pH值范围较窄,在6.0~7.0之间;枯草杆菌α-淀粉酶的最适pH值范围较宽,在5.0~7.0之间;嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶的最适pH值则在3.0左右;高粱芽α-淀粉酶的最适pH值范围为4.8~5.4;小麦α-淀粉酶的最适pH值在4.5左右,当pH值低于4时,活性显著下降,而超过5时,活性缓慢下降。根据α-淀粉酶的热稳定性可分为耐高温α-淀粉酶和中温-淀粉酶。在耐高温α-淀粉酶中,由淀粉液化芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产生的酶制剂已被广泛地应用于食品加工中。温度对这两种酶的活力影响不同,地衣芽孢杆菌-淀粉酶最适温度为92℃,而淀粉液化芽孢杆菌-淀粉酶的最适温度仅为70℃,除热稳定性存在差别外,这两种酶作用于淀粉的终产物也不相同 [1]。功能作用播报编辑水解淀粉分子链中的仅α-1,4-葡萄糖苷键,将淀粉链切断成为短链糊精、寡糖和少量麦芽糖和葡萄糖,使淀粉黏度迅速下降达到“液化”目的 [4]。毒理学依据播报编辑(1)LD50小鼠口服7375mg/kg。(2)ADI:可接受[来自米曲霉(JECFA,1987)];无需规定[来自枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(JECFA,1990)和地衣芽孢杆菌(JECFA,2003)]。(3)致突变作用。本品在体内无明显蓄积作用,无致突变作用 [4]。应用播报编辑α-淀粉酶主要用于水解淀粉制造饴糖、葡萄糖和糖浆等,以及生产糊精、啤酒、黄酒、酒精、酱油、醋、果汁和味精等。还用于面包的生产,以改良面团,如降低面团黏度、加速发酵进程,增加含糖量和缓和面包老化等。在婴幼儿食品中用于谷类原料预处理。此外,还用于蔬菜加工中。用量:以枯草杆菌α-淀粉酶(6000IU/g)计,添加量约为0.1% [3]。新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号 京公网安备110000020000OGO耐高温α-淀粉酶_百度百科
高温α-淀粉酶_百度百科 网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心收藏查看我的收藏0有用+10OGO耐高温α-淀粉酶播报讨论上传视频采用地衣芽孢杆菌经液体深层发酵、超滤等工序精制而成的酶OGO 耐高温α-淀粉酶(OGO Thermostable α-amylase)是采用地衣芽孢杆菌 ( Bacillus licheniformis )经液体深层发酵、超滤等工序精制而成,具有优良的热稳定性。产品能在较高的温度下迅速水解淀粉分子中α-1.4葡萄糖苷键,随机水解成长短不一的短链糊精和少量的低聚糖,使淀粉浆粘度迅速降低,广泛应用于淀粉加工、酒精、味精、柠檬酸、啤酒等行业 [1]。中文名OGO耐高温α-淀粉酶外文名OGO Thermostable α-amylase原 料地衣芽孢杆菌应 用淀粉加工、酒精、味精目录1适用温度2酶活定义3执行标准4抑制剂5使用说明6储存要求7保质期限8注意事项适用温度播报编辑最适作用pH范围5.8-7.8;最适作用温度90-95℃。在95-98℃时液化迅速,105℃时仍保持相当活力,在连续喷射液化中,瞬间温度可至105-110℃,仅需较低的钙离子浓度,一般[Ca2+]=50-70ppm足够。酶活定义播报编辑酶活:20000 U/mL1mL酶液 (或1g固体酶粉) 在70℃、pH6.0条件下,1min液化1mg可溶性淀粉所需的酶量,即为1个酶活力单位, 以U/mL (或U/g) 表示。执行标准播报编辑该产品执行中华人民共和国国家标准GB 8275-2009。抑制剂播报编辑铜、钛、钴等金属离子对本品有一定影响。铅、铝、锌等金属离子对本品有较强的抑制作用。使用说明播报编辑推荐的工艺条件温度95-105℃,使用喷射液化工艺时瞬间温度可达105-110℃;一般使用时应先调pH和加钙离子,再加入本品。使用高硬度水 (大于10德国度) 配料时,可不另加钙离子。添加量随淀粉底物、液化设备和控制条件等诸多因素的不同而不同。为求得最佳用酶量,建议在使用前先做一系列小型液化试验。一般液化每千克淀粉使用20000U/mL规格本品0.3-0.8mL。储存要求播报编辑建议密封储藏于干燥、低温的环境中 (≤25℃) ,最好在冷藏条件下 (4-8℃) 储藏。应置于干燥、通风、阴凉处,避免高温或阳光直射防曝晒、雨淋,禁止与有毒有害物质混运、混存。保质期限播报编辑25℃以下,液体酶储存3个月,固体酶储存12个月,保质期内酶活力不会低于产品标示的活力;4℃以下,可较长时间储存。注意事项播报编辑每次开袋或开桶后,若未使用完,应扎紧袋口或拧紧桶盖,以免受潮或污染。对于酶粉尘敏感的人来说,吸入酶粉尘可能会产生过敏反应。因此,建议使用固体酶制剂时,操作人员应穿工作服,带防尘面罩和手套,不要让本品溅入眼睛、口、鼻之中。 [2]新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号 京公网安备110000020000耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展
耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展
微生物学通报 2020, Vol. 47 Issue (5): 1589−1599
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文章信息
顾燕, 汤伟, 王悦, 戴宝, 卢德鹏, 许向阳, 何增国
GU Yan, TANG Wei, WANG Yue, DAI Bao, LU De-Peng, XU Xiang-Yang, HE Zeng-Guo
耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展
Advances in study on structure-function relationship of thermostable α-amylase and its heterologous expression
微生物学通报, 2020, 47(5): 1589-1599
Microbiology China, 2020, 47(5): 1589-1599
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190435
文章历史
收稿日期: 2019-05-20
接受日期: 2019-11-29
网络首发日期: 2020-01-02
Abstract
Figures
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顾燕, 汤伟, 王悦, 戴宝, 卢德鹏, 许向阳, 何增国. 耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展[J]. 微生物学通报, 2020, 47(5): 1589-1599.
GU Yan, TANG Wei, WANG Yue, DAI Bao, LU De-Peng, XU Xiang-Yang, HE Zeng-Guo. Advances in study on structure-function relationship of thermostable α-amylase and its heterologous expression[J]. Microbiology China, 2020, 47(5): 1589-1599.
耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展
顾燕1
,
汤伟1,2
,
王悦1
,
戴宝3
,
卢德鹏3
,
许向阳4
,
何增国1,2,4
1. 中国海洋大学医药学院 山东 青岛 266000;
2. 青岛海洋生物医药研究院 山东 青岛 266000;
3. 潍坊市信得生物科技有限公司 山东 潍坊 261000;
4. 枣庄市杰诺生物酶有限公司 山东 枣庄 277100
收稿日期: 2019-05-20; 接受日期: 2019-11-29; 网络首发日期: 2020-01-02
基金项目: 泰山学者建设工程专项经费;青岛市海洋生物医药科技创新中心建设专项(2017-CXZX01-5-3)
通信作者:
何增国, E-mail:bioantai88@vip.163.com.
摘要: 耐高温α-淀粉酶是数千年前即取得工业化应用的重要工业用酶。由于其具有热稳定性好、液化彻底、易保存等优势,在淀粉制糖、味精、啤酒等食品发酵以及纺织印染等行业都有着广泛的应用。本文首先就耐高温α-淀粉酶的菌种来源、结构与功能、α-淀粉酶酶活性提升、基因工程菌的构建等方面已取得的研究成果进行综述,然后对耐高温α-淀粉酶外源表达最新研究成果进行了总结。文章最后分析讨论了在耐高温α-淀粉酶开发方面国内现有水平与国际领先水平的差距,以期为耐高温α-淀粉酶的开发提供参考及思路。相信随着代谢工程和过量表达等技术手段的相继应用及业界的持续努力,我国耐高温α-淀粉酶的开发必将取得飞跃式发展。
关键词:
耐高温α-淀粉酶 菌种来源 分子结构 异源表达
Advances in study on structure-function relationship of thermostable α-amylase and its heterologous expression
GU Yan1
,
TANG Wei1,2
,
WANG Yue1
,
DAI Bao3
,
LU De-Peng3
,
XU Xiang-Yang4
,
HE Zeng-Guo1,2,4
1. School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao, Shandong 266000, China;
2. Marine Biomedical Research Institute of Qingdao, Qingdao, Shandong 266000, China;
3. Weifang Sinder Biotechnology Company Limited, Weifang, Shandong 261000, China;
4. Zaozhuang Jienuo Enzyme Company Limited, Zaozhuang, Shandong 277100, China
Received: 20-05-2019; Accepted: 29-11-2019; Published online: 02-01-2020
Foundation item: 'Taishan Scholar' Construction Program of Shandong Province; Qingdao Scientific and Technological Innovation Center for Marine Biomedicine Development Grant (2017-CXZX01-5-3)
*Corresponding author:
HE Zeng-Guo, E-mail: bioantai88@vip.163.com.
Abstract: Thermostable α-amylase is a group of important industrial enzymes famous for their earliest industrial usage tracing back to thousands of years ago. Thanks to their advantages such as thermal stability, high efficiency on starch liquefaction and the easy-to-stock nature, the thermostable α-amylase is widely used in starch-based sugar industries, food fermentation industries, beer and other brewing industries, and textile printing and dyeing associated industries, respectively. This review covered the advances in the studies on the thermostable α-amylase regarding the producer strains selection and construction, structure-function relationship of the enzyme, the ways for improving α-amylase enzyme activity and the approaches of heterologous expression of the enzyme, respectively. In addition, the status quo of thermostable α-amylase exploration worldwide was depicted in general, and the comparison between domestic achievements with the global leading establishments was made in the specific.
Keywords:
Thermostable α-amylase Strain source Molecular structure Heterologous expression
酶是一类非常重要的生物催化剂,因为其来源的天然性及良好的催化功能,数个世纪以来(自古巴比伦时期)就在食品等领域开始广泛应用[1]。淀粉酶是一种重要的水解酶类,是水解淀粉和糖原的一类酶的总称,淀粉酶通常作用于直链淀粉、可溶性淀粉、糖元、糊精等α-1, 4-葡聚糖糖苷键。淀粉酶分布广泛,几乎存在于所有的动植物和微生物中。最近统计表明淀粉酶产量已经占据酶制剂市场的30%左右[2]。 α-淀粉酶是淀粉酶中应用最广泛的酶种,其可以随机地从内部切断淀粉、糖原内的α-1, 4-葡萄糖苷键,将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖[3-4]。该类酶水解产物的末端残基碳原子的构型为A构型,所以称为α-淀粉酶。α-淀粉酶的pH适用范围十分广泛,pH在2.0–12.0之间均适用。根据催化作用温度的不同,α-淀粉酶可分为低温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶。相较于常温α-淀粉酶,耐高温α-淀粉酶有下述优点:(1)热稳定性更好,在工业生产的高温条件下稳定,能够长时间地发挥作用;(2)能够使淀粉的液化更加彻底,缩短糊化和过滤的时间,从而达到节约能源、降低成本的效果;(3)保存条件范围广、易于储存和运输等。因具有热稳定性和较宽的pH适应范围等特质,耐高温α-淀粉酶可直接在温度要求严苛的高温环境中发挥作用,有着较高的开发价值及应用价值。目前,耐高温α-淀粉酶已经逐渐发展为主流淀粉酶品种,广泛应用于淀粉制糖业、味精、啤酒等食品发酵行业以及纺织印染行业等[5-7]。 20世纪60年代末,酶水解理论在国外取得了决定性进展,使得淀粉酶法特别是高温淀粉酶水解工艺取得了重大的突破,逐渐取代了传统酸法,促使淀粉制糖工业获得了快速发展[8]。到了21世纪,丹麦、美国、日本等国家在构建地衣芽孢杆菌(Bacillus
licheniformis)、曲霉等基因工程菌的研发技术及蛋白质工程技术上相继取得了突破,生产性状更好的专利酶分子以及性能良好的基因工程菌被相继采用,高温淀粉酶制剂产业逐步发展成为一个为跨国集团(如诺维信等)所垄断的行业。近年来,国内的耐高温α-淀粉酶研发及工业化生产获得了长足发展,形成与跨国公司竞争的态势,尤其表现在玉米深加工行业,耐高温α-淀粉酶和糖化酶的淀粉喷射液化技术和双酶法糖化技术的普遍应用,全面促成了我国味精、淀粉糖、柠檬酸等生产技术的改进及产业的飞跃。 但是,国内耐高温α-淀粉酶的酶分子在性能、产品质量及生产效率诸方面与国外行业巨头(如诺维信等)相比仍有较大差距。如何开发高质量热稳定性更高的耐高温α-淀粉酶、有效地提高产量及生产效率仍是我国淀粉酶业界需要不断探索的问题。由于性能优良的淀粉酶分子已受到国外专利保护,又加之关键的代谢工程及外源表达技术多被行业巨头视为核心技术秘而不宣,密切跟踪α-淀粉酶酶分子相关结构与功能的最新研究成果、充分了解行业内α-淀粉酶的异源过量表达的前沿技术就显得尤为重要。此外,当前α-淀粉酶的热稳定性和嗜酸性已成为淀粉制糖业的关注热点,因此,继续筛选和选择有潜力、兼具耐热及耐酸淀粉酶分子的微生物就有着重要意义[9]。 本文综述了近年来产耐高温α-淀粉酶菌种的筛选研究进展,并对耐高温α-淀粉酶的结构和功能以及耐高温α-淀粉酶活力提升的途径进行了总结,最后对基因工程菌株构建以及耐高温α-淀粉酶异源表达等方面的最新进展进行了回顾。 1 产耐高温α-淀粉酶的微生物
最初用于工业生产的α-淀粉酶来自于真菌,曾被用作治疗消化系统疾病的药物辅助剂。随后的研究发现一些细菌来源的α-淀粉酶具有耐高温、耐酸或耐碱等极端环境条件的特性,能在高温工业生产的极端条件下保持催化性能。细菌中Bacillus属的48个种中有32个种可以产生α-淀粉酶,但是只有少数能够产生耐高温α-淀粉酶,常见的有地衣芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)等。细菌α-淀粉酶目前仍是淀粉液化水解处理的高温工业过程中使用最广泛的工业酶。其中,来自于地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶占据了相当大的市场。表 1列举了几种常见的不同来源耐高温α-淀粉酶产生菌及其最适温度的比较。
表 1 几种耐高温α-淀粉酶的不同来源
Table 1 Different sources of thermostable α-amylase
菌株Strains
最适反应温度Optimum reaction temperature (℃)
参考文献References
Alicyclobacillus sp.
75
[10]
Bacillus amyloliquefaciens
70
[11]
Bacillus flavothermus
60
[12]
Bacillus lentus
70
[13]
Bacillus licheniformis
100
[14]
Bacillus stearothermophilus
70–80
[15-16]
Bacillus subtilis
70
[17]
Chloroflexus aurantiacus
71
[18]
Desulfurococcus mucosus
100
[17]
Dictyoglomus thermophilum
90
[19]
Geobacillus bacterium
80
[20]
Geobacillus stearotermophilus
70
[21]
Halothermothrix orenii
60
[22]
Lactobacillus amylovorus
60–65
[23]
Lactobacillus plantarum
65
[24]
Lipomyces kononenkoae
70
[25]
Myceliophthora thermophila
100
[26]
Pyrococcus furiosus
100
[27]
Rhizopus oryzae
60
[28]
Pyrococcus woesei
100
[29]
Pyrodyctium abyssi
100
[30]
Rhizomucor pusillus
70
[31]
Rhodothermus marinus
61
[32]
Scytalidium thermophilum
60
[33]
Staphylothermus marinus
65
[17]
Thermococcus aggregans
100
[17]
Thermococcus celer
90
[17]
Thermococcus guaymagensis
100
[17]
Thermotoga petrophila
85
[34]
表选项
通过发现有潜力的产耐高温α-淀粉酶菌株,有可能拓宽高性能耐高温α-淀粉酶的筛选范围。最近,本课题在菌株筛选工作中组分离筛选到近10种性能较好的耐高温α-淀粉酶产生菌株,并且对其中一种高产耐高温α-淀粉酶的较新颖菌株热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)进行了专利保藏,相关的菌株诱变、发酵条件优化、酶分子功能评估等工作正在进行之中。 2 耐高温α-淀粉酶的结构与功能
2.1 耐高温α-淀粉酶的结构
在碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZy)数据库中,α-淀粉酶与GH-13家族中不同种类的糖基水解酶构成α-淀粉酶家族。该家族酶类作用于α-糖苷键并水解,以产生α-异头单糖或寡糖,或者形成α-1, 4或1, 6糖苷键(转糖基化),或者显示两种活性。 不同来源耐高温α-淀粉酶的一级结构一般不同,甚至氨基酸的相异性达到了70%以上(如P. woesei和地衣芽孢杆菌的相异性为71%[35]),但是不同来源耐高温α-淀粉酶的三级结构却高度相似,揭示α-淀粉酶催化活性的高低与三级结构有着更密切的关系。 就三级结构而言,所有耐高温α-淀粉酶均包含3个结构域,即结构域A、结构域B和结构域C。结构域A是由高度对称的α-螺旋和β-折叠交替组成的α/β桶装结构,该折叠结构包括8个平行的β-折叠体排列在一个桶中,边界为8个α-螺旋。结构域A充当催化结构域,酶蛋白质的N末端包含结构域A。此区域表现出较为刚性的特点,用于维持酶的基本构象。结构域B是一个小的突出环,位于TIM桶的第三β-折叠和第三α-螺旋之间。其具有不规则的β-片状结构,形成大的底物结合裂缝,并在不同的α-淀粉酶之间变化。结构域B被认为在α-淀粉酶的底物特异性差异中起作用。耐高温α-淀粉酶的催化活性口袋在结构域A和B之间,位于α/β桶状结构的底部。结构域C则构成α-淀粉酶的C端,其在蛋白质的稳定、折叠和底物结合中起着重要的作用[36]。底物结合位点即蛋白质的活性位点位于结构域A和B的羧基末端之间的长裂缝中。不同结构域间的连接及结构如图 1所示,其中A显示不同区域的分布与连接,B显示A区结构的α/β桶结构,催化位点残基位于其中。这类酶的一级序列具有7个高度保守的催化氨基酸区域,这些氨基酸序列有助于维持保守的TIM桶拓扑结构的稳定。
图 1 α-淀粉酶的结构
Figure 1 Structure of α-amylase
注:A:α-淀粉酶的结构域组织[37];B:结构域A α/β桶(TIM桶)的示意图[38].结构域A以绿色显示,结构域B以红色显示,结构域C以青色显示.
Note: A: The domain organization of α-amylase[37]; B: Schematic representation of the α/β barrel (TIM barrel) of domain A[38]. Domain A is shown in green, domain B is shown in magenta, and domain C is shown in cyan.
图选项
TIM桶包含4个高度保守的区域,分别位于β链3、β链4、β链5和连接β链7与α-螺旋7的回路中(图 2)。第一区域位于具有与底物的葡萄糖残基相互作用的His残基的β链3的C末端;第二区域具有Asp残基的β链4,其在催化过程中充当亲核试剂;第三区域则含有作为质子供体或受体的带有Glu残基的β链5;第四区域带有His残基和可能与底物的葡萄糖残基形成氢键的Asp残基的β链7[36]。
图 2 α-淀粉酶的拓扑结构
Figure 2 Topology of α-amylases
注:4个保守的序列模式的位置用虚线框表示[36].
Note: The positions of four conserved sequence patterns are indicated with dashed boxes[36].
图选项
2.2 耐高温α-淀粉酶的结构与热稳定性的关系
耐高温α-淀粉酶的酶活性与金属离子有着密切的关系。α-淀粉酶是一种金属活化酶,对Ca2+等阳离子具有高亲和力。一分子的α-淀粉酶内部至少含有一个Ca2+,用于维持酶的结构稳定和催化活性。通常认为,Ca2+的存在对耐高温α-淀粉酶的催化活性有着激活的作用。Li等[39]研究表明当耐高温α-淀粉酶AMY121加入5 mmol/L Ca2+时,在75 ℃下酶的半衰期从8.25 min增加到693.14 min,酶的热稳定性得到了大幅度提高。 不同来源的芽孢杆菌淀粉酶在结构上较为相似,但在热稳定性上却表现出很大的差别。Li等[39]对比了地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Bacillus licheniformis α-amylase,BLA)和解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(Bacillus amyloliquefaciens α-amylase,BAA)的结构,发现BLA与BAA两者氨基酸序列虽具有80%的同一性,但热稳定性却有较显著差异。BAA来源的α-淀粉酶热稳定结构域B较BLA来源的α-淀粉酶的结构域B在209及210位点多出2个氨基酸残基Glu-Gly,但前者的热稳定性显著低于后者。当在BLA的B结构域208、209位点插入Glu-Gly后,突变体BLA的α-淀粉酶热稳定性显著降低,而将该突变体所插入的Glu-Gly去除后,α-淀粉酶热稳定性又恢复如初。可见结构域B中类似位点仅有2个氨基酸的差异即可导致两种芽孢杆菌来源的α-淀粉酶热稳定性的显著差异。这种通过对关键位置氨基酸缺失或定点突变的研究方法,有助于阐明耐高温α-淀粉酶的耐热机理,也为提高芽孢杆菌嗜温α-淀粉酶的热稳定性提供了一种新思路。 通过比较嗜冷、嗜温、嗜热和极端嗜热生物体同源蛋白质稳定性的研究结果发现,天然蛋白质热稳定性的调整似乎是通过积累众多有限个体影响的突变而发生的[40]。在研究巨大芽孢杆菌(B. megaterium) α-淀粉酶耐热机制时,也可通过对钙离子结合位点的点突变实现耐热功能的显著提高。Ghollasi等[41]通过QuikChange定点诱变,用H. orenii耐高温α-淀粉酶(AmyA)的等同位置替代巨大芽孢杆菌WHO α-淀粉酶(Bacillus megaterium WHO α-amylase)假设钙结合环中的残基,如图 3所示,仅通过3个氨基酸取代实现了α-淀粉酶稳定的嗜热突变。该研究结果证实Ca2+的结合对活性和稳定性同时起作用,更紧密的钙结合增加了酶对热变性的抵抗力;通过操纵钙结合位点也可以改善α-淀粉酶的热稳定性。
图 3 GenBank和Swiss-Prot数据库中BMW-淀粉酶和相关蛋白的N末端结构域的多重比对[41]
Figure 3 Multiple alignments of N-terminal domain of BMW-amylase and related proteins in GenBank and Swiss-Prot databases[41]
注:氨基酸参与钙结合位点、选择诱变的氨基酸分别用灰色和黑色框标记,BMW-淀粉酶来自巨大芽孢杆菌WHO (ABU54057.1),AmyA来自H. orenii (AAN52525).
Note: The amino acids participate in the calciumbinding sites and the ones selected for mutagenesis are marked by gray and black boxes, respectively. BMW-amylase is from B. megaterium WHO (ABU54057.1) and AmyA is from H. orenii (AAN52525).
图选项
随着分子生物学技术手段在α-淀粉酶研究中的广泛应用以及生物信息学工具的建立,对不同来源α-淀粉酶结构域序列的系统发育分析比较成为可能[42]。Huma等[43]选择古细菌P. furiosus、5个芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和B. KSM K38)以及真核细菌米曲霉等7种微生物物种来源的α-淀粉酶进行了分子序列数据的比较分析。尽管发现了淀粉酶分子中3个保守区域,但以NCBI的BioEdit进行的生物信息学分析并没有揭示出分类上接近的芽孢杆菌淀粉酶在耐热序列分布上的相关性。可见,α-淀粉酶耐热功能可能也像前述的催化功能一样,更多取决于酶蛋白的空间结构而不是特定区域氨基酸序列。另外,来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶在70 ℃具有最佳活性,与嗜热的古细菌激烈热球菌的α-淀粉酶具有更多的序列相似性,它们的主要结构可以在耐热的激烈热球菌α-淀粉酶的基础上进行利用以改变其内在性和稳定性。通过比对大多数热稳定α-淀粉酶的蛋白序列特性,可以在热稳定性较低的α-淀粉酶中引入新的保守热稳定氨基酸序列或优化改进的序列,从而使后者具有更高的耐热性和生产性。随着用于比较分析DNA和蛋白质序列的系统发育方法技术的成熟,分子序列比较及蛋白空间结构预测技术得以相互关联,在此基础上形成用以改善酶催化活性及热稳定性的新的潜在技术手段。 3 耐高温α-淀粉酶的基因工程及外源表达
数十年来,耐高温α-淀粉酶工业历经野生菌株发酵、培养基优化及工艺改进等传统技术更新,逐步形成完整的工艺体系。进入21世纪后,引入外源基因、构建重组高效工程菌株并实现耐高温α-淀粉酶的改良表达已成为行业巨头取胜的法宝。用于淀粉酶生产的重组DNA技术之一是选择有效的淀粉酶基因并将基因插入合适的载体系统,且在有效的细菌系统中转化以产生过量表达的重组蛋白[44]。在该技术中,基因的高拷贝数往往能促进淀粉酶的更高产率[45]。 随着基因工程技术的不断发展,构建原核系统外源表达成为了研究的主流。目前研究较多的是将野生菌中的耐高温α-淀粉酶基因导入到外源表达系统中,以此来提高耐高温α-淀粉酶酶活,或根据自己的需要构建筛选出性能良好的菌株。Jiang等[46]将Geobacillus sp. 4j的热稳定α-淀粉酶基因转化到大肠杆菌BL21中进行表达,产量增加了22倍。Ghasemi[47]将来自P. woesei的耐高温α-淀粉酶基因克隆到pTYB2载体并导入大肠杆菌BL21中,成功使酶活提高到185 U/mL。董晨等[48]比较了两种启动子对地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌A752S中表达水平的差异,研究表明强启动子P43可使耐高温α-淀粉酶表达水平提高8.9倍。刘金岚等[49]将来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌NUB3621的耐高温α-淀粉酶基因导入到枯草芽孢杆菌1A751中并进行发酵,酶活可高达1 393.3 U/mL。 相较于原核表达系统,真核表达系统的发展则较为缓慢。但是随着研究者们对于真核生物遗传表达机制研究的不断深入,以及科技水平的不断提高,人们已经开始在昆虫、酵母、哺乳动物细胞中实现了外源基因的表达。一般来说,来源于高等生物的外源基因更适合在真核生物表达系统中表达[8]。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统因其蛋白产量大、活性高、稳定性和安全性好等优势,近年来得到了充分的开发利用。柯涛等[50]把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶基因BD5088转化到毕赤酵母GS115中,使其最适反应温度提高了10 ℃,热稳定性也得到了较大的提高。He等[31]采用RT-PCR从嗜热真菌R. pusillus中克隆耐热α-淀粉酶基因,导入到P. pastoris KM71中进行异源表达,使得酶活最高可达32 100 U/mL。P. furiosus属于极端嗜热厌氧古细菌,需要严格无氧环境,一般原核表达系统都难以实现有效的分泌表达。郭建强等[51]将P. furiosus编码的耐热酸性α-淀粉酶基因在常温好氧的P. pastoris中实现了高效表达,构建了可以在常温有氧的条件下通过优化培养条件、改善生产工艺即可大规模培养获取外源蛋白表达量的基因工程菌。郝帅等[52]将P. furiosus超耐热酸性α-淀粉酶Amy转化到多型汉逊酵母HP-6中获得重组汉逊酵母,使得更容易筛选到高拷贝转化子,更加适用于大规模工业发酵。 要在给定的表达系统中取得淀粉酶的过量表达,规避代谢阻抑有着重要意义。多数淀粉酶的生物合成以糖类物质作为碳源,易受糖分解代谢物阻遏(catabolite repression,CR)。在发酵初期积累的分解代谢产物(如麦芽糖和葡萄糖)往往会导致淀粉酶生物合成受到分解代谢物抑制。因此,设计能规避CR的表达系统是淀粉酶大规模商业化生产中的一种重要策略。Nathan等[53]以地衣芽孢杆菌MSG耐高温α-淀粉酶作为模型,设计了一种来自强异源启动子的分解代谢物无抑制过表达方案,开发了自身可诱导、无分解代谢物抑制的表达系统。构建表达系统时,采用地衣芽孢杆菌CR关键5′cre操纵子缺失的淀粉酶基因与枯草芽孢杆菌磷酸盐饥饿诱导型强pst启动子融合的策略如图 4所示,从而规避葡萄糖抑制并增强淀粉酶的过量表达。在验证试验中,当培养基中加入高葡萄糖并提供有限磷酸盐时,该表达系统在枯草芽孢杆菌中的表达量比野生型菌株提高约300倍,比同基因克隆中天然启动子的产量高18.5倍。
图 4 B. licheniformis MSG无分解代谢物阻遏的表达质粒的构建[53]
Figure 4 Construction of expression plasmids for catabolite repression free expression of B. licheniformis MSG[53]
图选项
α-淀粉酶外源过量表达成为淀粉酶工业中工程菌构建的重要关注点。必须指出的是,工程菌株的过量表达仅为提高产量可能性提供了保障,要实现这种可能尚需保障所合成的淀粉酶能分泌到胞外,这才是实现产量提高最为关键的一步。为了获得工业上所需的酶产量,至关重要的是确定从转录、翻译到折叠和分泌的蛋白质生产路线中的潜在瓶颈。如果蛋白质在转运后没有快速正确折叠,它们会被存在于膜、细胞壁或细胞外培养基周围的几种蛋白酶降解。Quesada-Ganuza等研究表明[54],为保障α-淀粉酶的有效分泌,外源表达系统中有必要引入PrsA蛋白并与α-淀粉酶共表达。PrsA是一种负责芽孢杆菌胞外蛋白折叠的必不可少的胞外折叠催化剂蛋白。Quesada-Ganuza等[54]着手以枯草芽孢杆菌为宿主,将6个异源淀粉酶分别与6个异源PrsA共表达,构建了包含6个淀粉酶-PrsA对所有组合的菌株矩阵,他们的研究表明,异源PrsA共表达能将5种细胞外α-淀粉酶的最终产量提高2.5倍,并且异源PrsA的过表达对α-淀粉酶分泌的影响对共表达的α-淀粉酶具有特异性。Quesada-Ganuza等[54]还将2个PrsA进行重组,使PrsAB1的6个氨基酸用PrsABN的同位取代,产生新的重组PrsA称为PrsAB1-BN,如图 5所示。重组PrsAB1-BN突变体与α-淀粉酶共表达,与天然PrsAB1和PrsABN折叠酶相比,表面重塑的PrsAB1-BN折叠酶增加了总淀粉酶活性,并且降低了其分泌压力。总的来说,异源PrsA过表达能促进异源淀粉酶分泌,良好的PrsA-淀粉酶配对还可以降低枯草芽孢杆菌的分泌应激反应。
图 5 PrsAB1和PrsABN的建模结构
Figure 5 Modelled structures of PrsABl and PrsABN
注:A:来自枯草芽孢杆菌的PrsAB1;B:来自B. NSP9.1的PrsABN;C:重组PrsAB1-BN[54].
Note: A: PrsA from B. licheniformis; B: PrsA from B. NSP9.1; C: Recombinant PrsAB1-BN[54].
图选项
4 耐高温α-淀粉酶开发前景展望
经过半个多世纪的发展,α-淀粉酶产业已从最初的野生菌株分批式发酵生产模式跨入由代谢工程以及蛋白质工程催生的精准调控的工程菌可控式规模化生产阶段[8]。如今,丹麦、美国、日本等国家在芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶产业领域仍领先于其他国家。近年来,国内学术界及产业界在诱变育种、工程菌构建以及生产工艺优化等方面进行了长期的研发及开发,使耐高温α-淀粉酶产业得以显著提升和发展。就产业规模而言,也已形成与跨国企业分庭抗礼的态势。但目前纵览国内本土单个生产企业,尚无一家可与国际龙头企业匹敌。如何开发高质量、热稳定性更高的耐高温α-淀粉酶分子、如何构建过量表达的优良工程菌株以及如何开发先进的生产工艺以有效提高生产效率及降低生产成本,仍是我国淀粉酶业界需要不断努力的方向。 在重组耐高温α-淀粉酶酶活性方面如何减弱对Ca2+的依赖以使耐高温α-淀粉酶能够更加广泛、灵活地用于各个领域且适应各种条件,也是亟待解决的主要关键点。超嗜热古细菌一般耐受温度较高,pH稳定范围也比较广泛,特别是其热稳定性并不依赖Ca2+,比如P. woesei[47]、Thermococcus siculi[55]等超嗜热古细菌的耐高温α-淀粉酶基因工程菌的构建已有报道,或许可成为有潜力的耐高温α-淀粉酶基因来源。 耐高温α-淀粉酶的研发如基因工程菌的构建、代谢工程的应用等方面,分子生物学技术主导的精确控制手段将成为研发热点。例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子在葡萄糖存在下会被抑制10–15倍,使用顺式调节序列的分解代谢物阻遏(CR)抗性突变体或反式调节蛋白如CcpA,淀粉酶表达也仅增加3–10倍[53]。在此情况下,设计无抑制的分解代谢物增强的表达系统、废除CR的策略成为酶过量表达生产中的重要考虑因素。经研究[54],消除这一抑制因素表达量将会比同基因克隆增强数倍,然而目前对这一方向的研究较少,实现无抑制、生长解离且经济高效地生产碳抑制酶和其他重组蛋白是亟待解决的关键环节之一。 必须指出的是,工程菌株的过量表达仅是耐高温α-淀粉酶产量提高的必要条件,要实现这种可能,尚需保障所合成的淀粉酶能分泌到胞外,这才是实现产量提高的最为关键的一步。为了获得工业上所需的酶产量,至关重要的是确定从转录、翻译到折叠和分泌的蛋白质生产路线中的潜在瓶颈,异源蛋白生产遇到的瓶颈在不同阶段均有发现,而克服这一瓶颈也是未来需要致力的另一个关键环节。 综上所述继续筛选性能更好的耐高温α-淀粉酶分子、加强优良工程菌的构建以及基于代谢工程设计的高效外源表达体系的构建及规模化上下游工艺的优化将是一项长期任务[56]。相信随着代谢工程及蛋白质工程技术的进步及新生产工艺的革新,我国的淀粉酶行业,特别是高温α-淀粉酶的研发将迎来光明的前景。
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α-淀粉酶(高温淀粉酶)(α-Amylase from Aspergillus oryzae)
CAS: 9001-19-8
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主页 产品生物化工酶及辅酶类 α-淀粉酶(高温淀粉酶)
中文名 α-淀粉酶(高温淀粉酶)英文名 α-Amylase from Aspergillus oryzae别名 Α-淀粉酶他卡淀粉酶糖化素α-淀粉酶(高温淀粉酶)英文别名 α-AmylaseTAKA-DIASTASETAKA-AMYLASE Aα-amylase,thermostableFungal Amylase (FungamylTM1,4-α-D-Glucan-glucanohydrolaseα-Amylase from Aspergillus oryzaeAmylase,.alpha.-,Aspergillusoryzaealpha-amylasefromaspergillusoryzaeCAS 9001-19-8EINECS 232-588-1存储条件 2-8°C外观 悬挂颜色 yellow-brownMerck 13,9122物化性质 化学性质 高峰淀粉酶是从米曲霉培养液提取的消化酶的混合物,为黄白色粉末,在水中成浑浊的溶液,几乎不溶于乙醚。易吸潮,微臭,久贮后糖化力减弱,其溶液热至850C以上失去糖化力。在酸或碱存在下,糖化力减弱。它不仅能水解淀粉,而且还能消化蛋白质和脂肪。水解淀粉的能力是麦芽粉酶的1.5~2.0倍。最适pH4~6,其活性不受红茶、绿茶、咖啡等影响。危险品标志 Xn - 有害物品
风险术语 42 - 吸入可能致敏。
安全术语 S36 - 穿戴适当的防护服。
S36/37 - 穿戴适当的防护服和手套。
S24 - 避免皮肤接触。
S22 - 切勿吸入粉尘。
WGK Germany 3RTECS BU7432500FLUKA BRAND F CODES 3-10-21上游原料 糊精 琼脂粉 玉米粉 糖化酶 参考资料 展开查看 1. 刘淑婷 王颖 王志辉 等. 不同品种芸豆淀粉及其抗性淀粉结构和物化特性比较[J]. 中国食品学报 2020(4).2. 曲鹏宇 李志江 李丹 等. 乳熟中期水稻茎中水溶性膳食纤维提取工艺研究[J]. 黑龙江八一农垦大学学报 2020 032(002):37-42 118.3. 杨敏 杨勇 吴世涛 李彬彬 张楠 张学广 侯青 陈洪 林德荣 刘爱平 刘韫涛 李健 林燕.利用燕麦麸脂肪模拟物制作的发酵香肠对大鼠血脂水平及血清抗氧化性能的影响[J].食品科学 2018 39(05):239-246.4. 刘静怡 丁城 周梦舟 等. 双酶法分离提取米糠膳食纤维的研究[J]. 食品科技 2017(10):179-184.5. 李长见. 双酶法玉米汁饮料的研制[J]. 农产品加工 2018 No.453(07):22-25+28.6. 包怡红 冯雁波. 响应面试验优化红松松仁膳食纤维制备工艺及其理化性质分析[J]. 食品科学 2016(14期):11-17.7. 包怡红 郭阳. 响应面试验优化超声波辅助水酶法提取松籽油工艺及其氧化稳定性[J]. 食品科学 2016 37(22).8. 李艳, 张海芳, 韩育梅,等. 复合酶法提高马铃薯渣中可溶性膳食纤维含量的研究[J]. 食品科技, 2018, 43(12):211-217.9. 谢岩黎, 南永远, 郝振宇. 微波湿热-循环冷冻对小麦淀粉结晶特性的影响[J]. 中国粮油学报, 2017, 32(010):49-53.10. 谢岩黎, 王晨, 郝振宇. 抗性淀粉与小麦粉共混体系黏弹性的研究[J]. 中国粮油学报, 2018, v.33(02):33-38.11. 李长见, LI, Chang-jian,等. 抗氧化小米发酵饮料的研制[J]. 饮料工业, 2017, 06(v.20;No.175):30-33.12. 王燕. 正交试验优化小米饮料工艺[J]. 粮食与油脂, 2018, 31(10):53-56.13. 杨敏,杨勇,李彬彬,张楠,蒋玉涵,尚柔杉,杨海翌,刘爱平,刘韫涛,李诚.燕麦麸脂肪模拟物应用于发酵香肠的工艺优化及其对发酵香肠品质的影响[J].食品与发酵工业,2017,43(05):129-137.14. 阳雁, 李蒙蒙, 孙智达. 环境因素对米糠不溶性膳食纤维吸附蓝莓多酚的影响[J]. 食品工业科技, 2015, 36(018):137-140.15. 迟燕平, 胡楠楠, 姜媛媛,等. 米糠中淀粉脱除工艺优化研究[J]. 食品科技, 2016, 041(010):147-150.16. 胡楠楠, 卢敏, 迟燕平. 米糠阿魏酰低聚糖提取工艺优化研究[J]. 食品科技, 2016, 041(011):184-189.17. 王超, 徐红艳, 杨晰茗,等. 红松松仁膜衣膳食纤维的功能性质[J]. 食品与机械, 2020, 036(003):39-42,68.18. 王迪, 王颖, 张艳莉,等. 芸豆酵素复合发酵工艺优化[J]. 食品与机械, 2019, 035(010):206-209,236.19. 刘淑婷, 王颖, 王志辉,等. 超声-微波协同酶法制备芸豆抗性淀粉工艺优化及结构分析[J]. 中国食品学报, 2020, v.20(05):193-201.20. 申瑞玲, 张文杰, 董吉林. 酶-热水浸提法提取藜麦麸水溶性非淀粉多糖工艺研究[J]. 轻工学报, 2016, v.31;No.137(01):29-34.21. 张海芳, 李艳, 韩育梅,等. 酶法改性对马铃薯渣膳食纤维单糖组分及理化性质的影响[J]. 食品研究与开发, 2020, 041(001):60-66.22. 赵志浩, 刘磊, 张名位,等. 预酶解-挤压膨化对全谷物糙米粉品质特性的影响[J]. 食品科学, 2019, 40(01):116-124.23. 余可, 刘磊, 张瑞芬, et al. 预酶解-滚筒干燥加工工艺对全麦片品质的影响[J]. 中国农业科学, 2020, v.53(06):181-193.24. 王秋阳, 付刚, 王超,等. 高压超声波协同改性红松松仁膜衣膳食纤维工艺优化及结构分析[J]. 延边大学农学学报, 2019, 041(002):74-79.25. 曾泽生, 朱波, 邓姗. 高抗性淀粉苦荞乳饮料制备工艺研究[J]. 食品与发酵科技, 2016(4):7-11.26. 张婷, 李佳瑶, 安双双,等. 高粱抗性糊精的制备工艺优化及结构表征[J]. 食品科技, 2020, v.45;No.342(04):238-243.27. 申瑞玲, 林娟, 董吉林,等. 黑麦非淀粉多糖的分离纯化[J]. 麦类作物学报, 2014, 34(09).28. 张智, 李晴, 化洪苓,等. 橡子粉酶法制备低聚异麦芽糖的工艺研究[J]. 食品工业科技, 2017(21):158-163+168.29. 冯雁波, 包怡红. 超微粉碎对松仁膳食纤维体外降血糖、降血脂功能的影响[J]. 食品工业科技, 2016(23):343-347+351.30. 彭悦 柴利娜 乔臻然 等. 低脂型膳食纤维发酵香肠的研究[J]. 肉类工业 2019 000(007):1-6.31. 辛松林. 川秋葵微粉降血糖活性研究[C]// 第十三届中国西部营养与健康高峰论坛论文集. 2018.32. 姜龙波, 吕静, 张喜文,等. 小米糠膳食纤维复合酶法改性工艺优化[J]. 轻工学报, 2017, 32(005):16-23.33. 李鹏冲, 申瑞玲, 章建军,等. 麦麸多酚膳食纤维的提取工艺研究[J]. 食品工业, 2018, 39(12):88-91.34. 张玉梅 卢红梅 陈莉 等. 光照与否对苦荞芽苗的影响[J]. 食品科技 2018 043(006):183-188.35. 洪泽翰, 吴婉仪, 李璐,等. 不同大分子乳化剂构建番茄红素纳米乳液的体外消化规律比较[J]. 食品科学, 2019, 40(10):9-15.36. 陈尚龙, 刘恩岐, 陈安徽,等. 应用体外全仿生模型初步分析2种富硒产品中硒形态及生物可给性[J]. 食品科学, 2018, 039(004):225-232.37. 陈尚龙, 陈安徽, 刘辉,等. 应用消化系统全仿生模型分析酸奶发酵对钙形态的影响[J]. 农业工程学报, 2018, v.34;No.332(05):297-302.38. 胡方洋,张坤生,陈金玉,马葆菁,祁亚男,李芸,唐莉果,邓金香,宋健臣.玉米抗性淀粉的制备及其对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响[J].食品研究与开发,2021,42(07):1-6.39. 申瑞玲,李佳瑶,朱莹莹,董吉林.燕麦全谷微发酵饮品的研究[J].食品研究与开发,2021,42(02):78-83.40. 卜俊芝.混合果蔬酵素中生物活性成分及其应用研究[J].东莞理工学院学报,2020,27(05):90-94.41. 李莹莹,张星启,倪泽平,宋贤良. 酶碱结合法提取菠萝蜜皮中膳食纤维工艺研究[C]. 广东省食品学会.现代食品工程与营养健康学术研讨会暨2020年广东省食品学会年会论文集.广东省食品学会:广东省食品学会,2020:17-22.42. 乐乐,崔鑫儒,赵创谦,李婉麒,陈紫颖,汤柳茜,赖凤羲,艾连中,张汇.青稞多糖对玉米淀粉糊化和流变特性的影响[J].食品与生物技术学报,2020,39(10):73-81.43. 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α-淀粉酶(高温淀粉酶) - 性质α-淀粉酶,又称为高温淀粉酶,是一种能够在高温条件下催化淀粉分解的酶类。它主要存在于一些热带和温带的微生物中。α-淀粉酶具有以下几个主要特性:
1. 催化温度范围广:α-淀粉酶能够在较高温度下催化反应,通常在50℃到90℃之间具有最佳催化活性。
2. 酸碱稳定性:α-淀粉酶对酸碱度变化较为稳定,能够在酸性和碱性条件下保持一定的催化活性。
3. 高催化效率:α-淀粉酶能够高效地降解淀粉分子,将其水解成较小的糖分子,如葡萄糖和麦芽糖。
4. 产生较少副产物:与其他淀粉酶相比,α-淀粉酶在催化淀粉分解时产生的副产物较少,有助于提高纯度和产量。
5. 抗热性强:α-淀粉酶能够在高温条件下保持较好的稳定性和催化活性,因此在工业应用中受到广泛关注。
由于其独特的性质,α-淀粉酶在食品加工、酿造业、纤维素降解等领域具有广泛应用。最后更新:2024-01-02 23:10:35α-淀粉酶(高温淀粉酶) - 生产方法α-淀粉酶,也被称为高温淀粉酶,是一种酶类蛋白质,能够催化淀粉的水解作用。以下是α-淀粉酶的生产方法:
1. 选择产生α-淀粉酶的微生物: α-淀粉酶可以从多种微生物中提取,如放线菌、枯草杆菌等。选择一种优良的微生物株系用于生产。
2. 预处理种子菌:取得优良种子菌后,通过预处理方法来增强活性,例如通过适宜的培养基进行预培养、筛选出产生α-淀粉酶的高活性株系等。
3. 培养基的选择:选择适宜的培养基来支持微生物的生长和 α-淀粉酶的分泌。典型的培养基成分包括碳源(如葡萄糖、淀粉)、氮源(如酵母浸出物、氨基酸)、矿物盐等。
4. 发酵条件的优化:通过对温度、pH值、氧气供应、搅拌速度等条件的调控,优化发酵条件,以提高α-淀粉酶的产量和活性。
5. 酶的提取和纯化:将发酵液进行离心或超滤,将酶从培养基中分离出来。接下来,通过各种分离纯化技术,如凝胶过滤、离子交换、亲和层析等,使酶获得较高的纯度和活性。
这些步骤可以在大规模工业生产中实施,以获得足够的α-淀粉酶供应,并用于食品加工、酿酒、纺织、造纸等行业。最后更新:2024-01-02 23:10:35
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一株高温酸性淀粉酶产生菌的分离、筛选、鉴定及其酶学性质研究
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杨力权, 杨国保, 陈贵元, 桑鹏. 一株高温酸性淀粉酶产生菌的分离、筛选、鉴定及其酶学性质研究[J]. 云南大学学报(自然科学版), 2019, 41(5): 1047-1054. doi: 10.7540/j.ynu.20180722
引用本文:
杨力权, 杨国保, 陈贵元, 桑鹏. 一株高温酸性淀粉酶产生菌的分离、筛选、鉴定及其酶学性质研究[J]. 云南大学学报(自然科学版), 2019, 41(5): 1047-1054. doi: 10.7540/j.ynu.20180722
YANG Li-quan, YANG Guo-bao, CHEN Gui-yuan, SANG Peng. Isolation, screening and identification of a thermostable acidic amylase-producing strain and its enzymatic properties[J]. Journal of Yunnan University: Natural Sciences Edition, 2019, 41(5): 1047-1054. DOI: 10.7540/j.ynu.20180722
Citation:
YANG Li-quan, YANG Guo-bao, CHEN Gui-yuan, SANG Peng. Isolation, screening and identification of a thermostable acidic amylase-producing strain and its enzymatic properties[J]. Journal of Yunnan University: Natural Sciences Edition, 2019, 41(5): 1047-1054. DOI: 10.7540/j.ynu.20180722
一株高温酸性淀粉酶产生菌的分离、筛选、鉴定及其酶学性质研究
杨力权,
杨国保,
陈贵元,
桑鹏
Isolation, screening and identification of a thermostable acidic amylase-producing strain and its enzymatic properties
YANG Li-quan,
YANG Guo-bao,
CHEN Gui-yuan,
SANG Peng
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摘要:
淀粉酶作为水解淀粉和糖原的酶类,在生物的新陈代谢和工业化生产中起着广泛而重要的作用,尤其是高温淀粉酶在利用过程中备受关注. 从云南大理市弥渡县石夹泉热泉的43 ℃底泥中分离并筛选到1株高温淀粉酶的高产菌,进行显微形态及生理生化特征、16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的一株菌,命名为Bacillus sp. Amy-43. 对其生长条件及酶学性质进行了研究,结果表明:该菌株耐高温性较好,菌株在55 ℃仍能生长,菌株最适生长温度为37 ℃. 所产淀粉酶最适酶活温度为75 ℃,最适反应pH值为4.0. 在37 ℃以下,能保持良好的稳定性,Zn2+和Mn2+对该酶有一定的抑制作用,而Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均对该酶活力起到促进作用,其中Cu2+的促进效果最为明显. 这些特性预示着Bacillus sp. Amy-43来源的淀粉酶为工业运用提供了重要的酶源.
Abstract:
Amylase, as an enzyme for hydrolyzing starch and glycogen, plays an important role in metabolism and industrial production. A strain of high-temperature amylase-producing bacteria was isolated and screened from the sediment of Shijiaquan hot spring in Midu County, Dali City, Yunnan Province. Its morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rRNA gene sequence analysis were carried out. The strain was identified as a strain of Bacillus sp., and named as Bacillus sp. Amy-43. The growth conditions and enzymatic properties of this strain were studied. The results showed that Bacillus sp. Amy-43 was resistant to high temperature and could still grow at 55 °C. The optimum growth temperature was 37 °C. The optimum enzyme activity temperature for amylase production was 75 °C, and the optimum reaction pH value was 4.0. Zn2+ and Mn2+ had a certain inhibitory effect on the enzyme. Ca2+, K+, Mg2+, Fe2+, Cu2+ all played a role in promoting the activity of the enzyme, of which Cu2+ was the most obvious. These characteristics indicate that the amylase from Bacillus sp. Amy-43 provides an important enzyme source for industrial application.
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耐高温α-淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因的克隆
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230
作者:
陈晨
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摘要:
耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一,约占酶制剂市场25%的比例。耐高温α-淀粉酶能在较高温度下能够有效快速的分解淀粉,被广泛应用于纺织退浆、发酵、制糖等高温条件下生产工业。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是国内生产耐高温α-淀粉酶的代表菌株之一。 为了获得纺织工业中所需求的耐高温α-淀粉酶,从枯草堆、农田积肥、下水道等处土样中分离得到一株能向胞外分泌耐高温α-淀粉酶的菌株并对其所产酶的酶学性质进行了研究。通过生理生化及分子生物学鉴定,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并初步命名为Bacillus subtilis C1。Bacillus subtilis C1在基础培养基中(pH 7,温度45℃)培养24h左右达到生长稳定期,在68h时酶活达到最高,为185.6 u·mL~(-1)。对该菌株分泌的耐高温α-淀粉酶的性质研究表明,此α-淀粉酶最适作用pH值为6,最适温度为70℃。酶的耐热性能较好,在70℃下处理1h,仍具有81%的酶活,适合纺织品高温退浆的需要。 为了获得较高的酶活和产量,在实验中,利用Minitab软件中Plackett-Burman设计和响应面分析法,对耐高温α-淀粉酶产生菌Bacillus subtilis C1的发酵培养条件进行了优化。在单次单因子法得出的适宜条件基础之上,综合考虑了所有影响酶活的因素,并对培养条件进行了统计分析,得到了Bacillus subtilis C1产耐高温α-淀粉酶的最佳培养条件。结果表明:优化培养基的组成(200 mL)为麸皮2.16g,棉粕粉1.98g,酵母粉0.40g,NaCl 1.00g,CaCl_2 0.40g,淀粉0.10g。该营养条件下的酶活为2329 u·mL~(-1),约是培养基优化前酶活的12.6倍,酶活有了显著的提高。 根据Gene Bank中已知的α-淀粉酶基因保守序列设计出特异性引物,通过PCR方法从Bacillus subtilis C1基因组DNA中扩增出了预期的1.5kb左右的特异性产物。该片段与已报道的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶编码基因分别有100%和99%的同源性。最大阅读框为1545bp,信号肽序列93bp。重新设计引物,获得去除信号肽的α-淀粉酶编码基因,并将其与pPICZαA载体连接后,电击转化Top 10 F'菌株的感受态细胞,经质粒抽提、酶切鉴定,确认该目的产物已得到成功克隆。该基因的克隆,为构建α-淀粉酶的工程菌奠定了基础。
展开
关键词:
α-淀粉酶
枯草芽孢杆菌
发酵条件
酶基因
基因克隆
学位级别:
硕士
学位年度:
2009
DOI:
10.7666/d.y1534844
被引量:
6
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淀粉酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化
淀粉酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化
微生物学通报 2022, Vol. 49 Issue (1): 173−188
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文章信息
王屈祎, 钟倩, 闫如玉, 马醒佳, 王会, 刘思瑜, 吴凌天
WANG Quyi, ZHONG Qian, YAN Ruyu, MA Xingjia, WANG Hui, LIU Siyu, WU Lingtian
淀粉酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化
Screening and identification of amylase-producing strain and optimization of the fermentation conditions
微生物学通报, 2022, 49(1): 173-188
Microbiology China, 2022, 49(1): 173-188
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.210301
文章历史
收稿日期: 2021-03-26
接受日期: 2021-07-08
网络首发日期: 2021-09-13
Abstract
Figures
Tables
引用本文 0
王屈祎, 钟倩, 闫如玉, 马醒佳, 王会, 刘思瑜, 吴凌天. 淀粉酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化[J]. 微生物学通报, 2022, 49(1): 173-188.
WANG Quyi, ZHONG Qian, YAN Ruyu, MA Xingjia, WANG Hui, LIU Siyu, WU Lingtian. Screening and identification of amylase-producing strain and optimization of the fermentation conditions[J]. Microbiology China, 2022, 49(1): 173-188.
淀粉酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化
王屈祎1,2
,
钟倩1
,
闫如玉1
,
马醒佳1
,
王会1
,
刘思瑜1
,
吴凌天1,3,4,5
1. 常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏 常熟 215500;
2. 南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;
3. 南京工业大学生物与制药工程学院,江苏 南京 211816;
4. 江苏久吾高科技股份有限公司,江苏 南京 211808;
5. 张家港市滨江有机农庄有限责任公司,江苏 苏州 215618
收稿日期: 2021-03-26; 接受日期: 2021-07-08; 网络首发日期: 2021-09-13
基金项目: 国家自然科学基金(21908011);中国博士后基金(2020M681571);江苏省自然科学基金(BK20191028);张家港市科技支撑计划(ZKN2008)
摘要: 【背景】 淀粉酶可以水解淀粉,在淀粉制糖、白酒、黄酒、啤酒和食醋等食品发酵行业有着广泛的应用。【目的】 从高温酒曲中筛选获得产淀粉酶的芽孢杆菌属菌株,并对其进行分类鉴定和产淀粉酶发酵条件优化,为发酵过程提供优良的淀粉酶资源。【方法】 取高温酒曲,经过富集培养和可溶性淀粉平板筛选培养基初筛,摇瓶复筛得到高产淀粉酶的菌株;通过菌落形态、革兰氏染色观察和16S rRNA基因序列比对进行菌株鉴定;通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken design试验考察培养基成分(碳源、氮源和金属离子)和发酵条件(温度、pH和接种量)对淀粉酶产量的影响,确定最佳产淀粉酶培养基和发酵条件,并将淀粉酶应用于淀粉水解。【结果】 筛选获得一株高产淀粉酶的菌株LT-2,经鉴定为Bacillus velezensis LT-2;B. velezensis LT-2产淀粉酶的最佳发酵参数为:麦芽糖8.00 g/L,大豆分离蛋白8.69 g/L,氯化铵3.00 g/L,氯化钙13.94 mmol/L,发酵初始pH 7.5,温度34.08 ℃,接种量6%。在最佳发酵参数下,B. velezensis LT-2经33 h发酵淀粉酶产量为972.88 U/mL,是优化前的5.01倍;5 L发酵罐中发酵,B. velezensis LT-2发酵51 h淀粉酶产量可达(1 198.40±4.56) U/mL,是摇瓶发酵的1.23倍,是发酵参数优化前摇瓶发酵的6.17倍;B. velezensis LT-2所产淀粉酶具有较好的淀粉水解能力,水解速率为6.17×10−5 g/(U·h)。【结论】 B. velezensis LT-2在淀粉酶分泌和淀粉水解方面具有良好的应用前景,研究结果为酒曲糖化能力和液化力的改善提供了理论支持。
关键词:
淀粉酶 筛选鉴定 发酵条件优化 贝莱斯芽孢杆菌 酶活
Screening and identification of amylase-producing strain and optimization of the fermentation conditions
WANG Quyi1,2
,
ZHONG Qian1
,
YAN Ruyu1
,
MA Xingjia1
,
WANG Hui1
,
LIU Siyu1
,
WU Lingtian1,3,4,5
1. College of Biological and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, Jiangsu, China;
2. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China;
3. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu, China;
4. Jiangsu Jiuwu High-Tech Company Limited, Nanjing 211808, Jiangsu, China;
5. Zhangjiagang Binjiang Organic Farm Company Limited, Suzhou 215618, Jiangsu, China
Received: 26-03-2021; Accepted: 08-07-2021; Published online: 13-09-2021
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (21908011); China Postdoctoral Science Foundation (2020M681571); Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20191028); Zhangjiagang Science and Technology Development Project (ZKN2008)
*Corresponding author:
WU Lingtian, E-mail: wlt913@cslg.edu.cn.
Abstract: [Background] Amylase hydrolyses starch and has a wide range of applications in the food fermentation industry, including starch-based sugar, white wine, yellow wine, beer, and vinegar. [Objective] In order to provide excellent amylase resources, an amylase-producing Bacillus strain was screened from high-temperature Jiuqu, and its classification and identification were carried out, and the fermentation conditions of amylase production were optimized. [Methods] The Bacillus strain was identified by colony morphology, Gram staining, and 16S rRNA gene sequence analysis. The effects of medium composition (carbon source, nitrogen source, and metal ions) and fermentation conditions (temperature, pH, and inoculum size) on amylase production was evaluated by single factor experiment, Plackett-Burman experiment, steepest climb experiment, and Box-Behnken design experiment. The optimum medium and fermentation conditions were applied to amylase production using starch hydrolysis. [Results] A high amylase producing strain LT-2 was obtained and identified as Bacillus velezensis LT-2. The optimum fermentation parameters for amylase production by B. velezensis LT-2 are maltose 8.00 g/L, soy protein isolate 8.69 g/L, ammonium chloride 3.00 g/L, calcium chloride 13.94 mmol/L, initial fermentation pH 7.5, temperature 34.08 ℃, and inoculum size 6%. B. velezensis LT-2 had an extracellular amylase activity of 972.88 U/mL in 33 h incubation under optimal fermentation parameters, which was 5.01 times higher than that before optimization; it had an amylase production of (1 198.40±4.56) U/mL in 51 h incubation in a 5 L fermenter, which was 1.23 times higher than in shake flask level and 6.17 times higher than in shake flask level (before optimization). The amylase produced by B. velezensis LT-2 had a good starch hydrolysis ability, and the hydrolysis rate was 6.17×10−5 g/(U·h). [Conclusion] B. velezensis LT-2 has promising applications in amylase secretion and starch hydrolysis, which provides theoretical support for the improvement of saccharification capacity and liquefaction power of Jiuqu.
Keywords:
amylase screening and identification fermentation parameters optimization Bacillus velezensis enzyme activity
淀粉酶来源广泛,如植物、动物、细菌和真菌[1-2],能将淀粉水解为糊精和一系列以葡萄糖为组成单位的低聚糖。由于其具有温和、高效和专一的特点,淀粉酶的应用已遍布各个领域,包括食品、制药、纺织和造纸等行业,是目前生产量最大、应用范围最广的一种水解酶[3-6]。 众所周知,酒是由优质粮谷类(淀粉)为原材料制成的,而酒曲在酿酒过程中具有糖化、发酵和生香等作用,其中淀粉糖化程度可以直接影响到酒的产量及质量[7]。覃雪珍等[8]研究表明添加淀粉酶可以提高浓香型白酒的出酒率和酒体品质;安琦琦[9]研究表明淀粉酶的添加不仅可以提高出酒率,还能缩短清香型白酒发酵周期;钟浩等[10]在黄酒生产过程中添加淀粉酶,结果显示黄酒出酒率明显提升,高达92.06%,其感官评价结果也得到了提升。目前,产淀粉酶的菌株主要是芽孢杆菌属微生物[6],如凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等。虽然放线菌、霉菌等也能产淀粉酶[6],但就芽孢杆菌产酶量高、发酵周期短、成本低和易于规模化生产等优势来看,其更有发展前景。因此,本文拟从高温酒曲中筛选获得产淀粉酶的芽孢杆菌属菌株,对其进行分类鉴定并优化产酶培养基和发酵条件,为改善酒曲糖化能力和液化力提供支持,以便有效控制酒曲制备工艺与酒曲质量,这对提高白酒的品质有着重要的理论意义和实践价值。 1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器及培养基
高温酒曲为市购;胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司;基因组小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;其余试剂和药品均为国产分析纯。 超净工作台、高速冷冻离心机,上海善志仪器设备有限公司;高压蒸汽灭菌锅、5 L发酵罐,上海百仑生物科技有限公司;恒温培养箱、全温摇床,苏州培英试验设备有限公司;pH计,上海雷磁仪器仪器有限公司;酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;PCR仪,Eppendorf公司;核酸电泳仪:Bio-Rad公司。 富集培养基(g/L):酵母浸膏5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0,可溶性淀粉5.0,供产淀粉酶菌株富集。 筛选培养基(g/L):牛肉膏0.5,酵母粉10.0,KH2PO4 20.0,MgSO4·7H2O 0.5,可溶性淀粉10.0,琼脂20.0,供产淀粉酶菌株筛选。 LB培养基成分与李习[11]报道一致,供细菌活化。 1.2 种子液培养方法
将Bacillus velezensis LT-2 (贝莱斯芽孢杆菌LT-2,以下简称菌株LT-2)在LB平板上37 ℃条件下活化24 h,形成单菌落后用接种环接种于LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min条件下培养12−16 h,得种子液。 1.3 淀粉酶产生菌株的筛选与鉴定
称取1 g高温酒曲加入富集培养基中,30 ℃、200 r/min条件下培养24 h后进行梯度稀释(10−4、10−5、10−6、10−7、10−8),采用10−5稀释液涂布于筛选培养基上,30 ℃培养2 d。向筛选培养基滴加卢戈氏碘液后测定透明圈直径(D)和菌落直径(d),并计算D/d值。 以基因组小提试剂盒提取D/d值最高的菌株基因组DNA,以电泳验证后的基因组DNA为模板,采用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′) PCR扩增菌株16S rRNA基因片段。PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化后,送至苏州金唯智生物科技有限公司测序,测序结果提交GenBank数据库,并将所测序列进行相似性比对,构建系统发育树。 1.4 菌株LT-2产淀粉酶的发酵培养基优化
以LB液体培养基为基础培养基,在接种量为3%、初始pH值为6.5、培养温度为37 ℃、摇床转速为200 r/min条件下,以淀粉酶产量为响应值,对碳源(菊粉、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖和乳糖浓度分别为10.0 g/L)、麦芽糖(浓度为2.0−18.0 g/L)、有机氮源(胰蛋白胨、玉米浆干粉、黄豆饼粉、酵母膏、麦芽浸粉、大豆分离蛋白和蛋白胨浓度分别为10.0 g/L)、大豆分离蛋白(浓度为2.0−16.0 g/L)、无机氮源(尿素、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、亚硝酸铵和硝酸钙浓度分别为5.0 g/L)、氯化铵(浓度为1.5−12.0 g/L)、金属离子(氯化钙、氯化锌、氯化镁、氯化钡和硫酸锰浓度分别为1.0 mmol/L)、氯化钙(浓度为1.0−30.0 mmol/L)进行优化。 1.5 菌株LT-2产淀粉酶的发酵条件优化
在1.4的基础上,以淀粉酶产量为响应值,对发酵温度(24−38 ℃)、发酵液初始pH值(3.5−10.5)和接种量(1%−8%)进行优化。 1.6 Plackett-Burman试验
在单因素优化结果的基础上,利用Plackett-Burman试验[12]从7个因子(麦芽糖、大豆分离蛋白、氯化铵、氯化钙、温度、pH和接种量)中筛选出对菌株LT-2淀粉酶产量具有显著影响的因子。 1.7 最陡爬坡试验
为确定最佳响应值区域,建立响应面的拟合方程,采用最陡爬坡试验进一步确定影响B. velezensis LT-2产淀粉酶活力因素的最佳参数。 1.8 Box-Behnken design响应面试验
根据最陡爬坡试验结果,采用Box-Behnken Design (BBD)试验对淀粉酶活力影响最大的4个因素(大豆分离蛋白、pH、温度和氯化钙)进行优化试验,以确定菌株LT-2最佳产酶条件。 1.9 菌株LT-2分批发酵产淀粉酶
在最佳发酵参数条件下,分别在5 L发酵罐和500 mL摇瓶中进行淀粉酶发酵,每3 h取样测定淀粉酶活力和菌体量,绘制淀粉酶酶活曲线和菌体生长曲线。摇瓶发酵产淀粉酶:以4%的接种量将种子液接种于100 mL发酵培养基中,在30 ℃、200 r/min条件下发酵培养24 h。发酵罐发酵产淀粉酶条件:以6%的接种量将种子液接种于3 L发酵培养基中,在34 ℃、300 r/min条件下发酵培养,pH (7.50±0.05),通气量为1.1 vvm。 1.10 菌株LT-2淀粉酶水解淀粉
将1.9中所获发酵液在4 ℃、5 000 r/min条件下离心20 min,上清液即粗淀粉酶液。将9 500 U淀粉酶加入淀粉溶液中,混匀后在37 ℃、pH 6.5条件下进行水解反应,每隔0.5 h取样,用DNS法测定样品中还原糖含量。 1.11 分析方法
淀粉酶酶活参照杨心意[13]和苟亚蜂[14]报道的方法测定,菌体干重参照Wang等[15]报道的方法测定。 2 结果与分析
2.1 菌株的筛选和鉴定
通过筛选获得12株产淀粉酶菌株,其中菌株LT-2产酶能力较强。由图 1A可知,菌株LT-2菌落边缘粗糙且不规则,菌落起皱呈白色;菌体为杆状,有芽孢,革兰氏染色呈阳性(图 1B);从卢戈氏碘液染色显色透明圈可知菌株LT-2可分泌淀粉酶,而且D/d值达到2.56 (图 1C)。
图 1 菌株LT-2的菌落形态(A)、细胞显微镜检图(B)和卢戈氏碘液染色图(C)
Figure 1 Colony morphology (A), photomicrograph (B) and the graph of Lugol's iodine staining (C) of strain LT-2.
图选项
以菌株LT-2基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得16S rRNA基因片段,测序后提交GenBank数据库并进行同源比对,发现菌株LT-2与贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) zjt9的一致性达到100%。根据菌株形态和测序分析结果将菌株LT-2鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) LT-2 (GenBank登录号MN822654) (图 2)。
图 2 菌株LT-2与其他相近菌株基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树
Figure 2 Phylogenetic tree based on a comparison of the 16S rRNA gene sequences of strain LT-2 and related strains. Numbers in parentheses are the accession numbers of related strains, the numbers in each branch points are percentages supported by bootstrap, bar=0.005 is nucleotide divergence.
括号中序号是相关菌株的登录号,分支点上的数字是bootstrap支持率,标尺刻度0.005是序列差异的分支长度
图选项
2.2 发酵培养基优化
2.2.1 碳源对菌体量和淀粉酶产量的影响
碳源是培养基的主要成分,其主要功能是为合成菌体提供碳骨架并为微生物生长提供能源。由图 3A可知,以菊粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖为唯一碳源时,菌株LT-2菌体量基本一致,但以麦芽糖为碳源时,淀粉酶产量远高于其他碳源。虽然麦芽糖和葡萄糖均为淀粉水解产物,但以葡萄糖为碳源时的淀粉酶产量仅为麦芽糖的74.65%。由图 3B可知,随着麦芽糖浓度的增加淀粉酶活力逐步增加;当麦芽糖浓度为8−10 g/L时淀粉酶活力达到最大值,继续增加麦芽糖浓度,淀粉酶产量反而下降。因此,最佳麦芽糖浓度为8 g/L。
图 3 碳源种类(A)和麦芽糖浓度(B)对菌体量及淀粉酶产量的影响
Figure 3 Effects of carbon sources (A) and maltose concentrations (B) on cell biomass and amylase production. Con: Control; Inu: Inulin; Suc: Sucrose; SS: Soluble starch; Mal: Maltose; Glc: Glucose; Frc: Fructose; Lac: Lactose. Different lowercase letters mean significant (P < 0.05). The same below.
Con:对照;Inu:菊粉;Suc:蔗糖;SS:可溶性淀粉;Mal:麦芽糖;Glc:葡萄糖;Frc:果糖;Lac:乳糖。不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同
图选项
2.2.2 有机氮对菌体量和淀粉酶产量的影响
氮源是菌体合成氨基酸、蛋白质、核酸及含氮代谢物的物质。由图 4A可知,黄豆饼粉、酵母浸膏和麦芽浸粉可以促进菌体快速繁殖,但淀粉酶产量并未随着菌体量的增加而增加。当以大豆分离蛋白为有机氮源时,虽然菌体量仅为(0.95±0.08) g/L,但淀粉酶产量最高,是对照组的7.71倍。由图 4B可知,随着大豆分离蛋白浓度的升高,菌体量缓慢上升,淀粉酶产量也不断上升,当浓度为10 g/L时淀粉酶产量最大,随后淀粉酶产量急剧下降,因此选择10 g/L为最佳大豆分离蛋白浓度。
图 4 有机氮种类(A)和大豆分离蛋白浓度(B)对菌体量及淀粉酶产量的影响
Figure 4 Effects of organic nitrogen sources (A) and soy protein isolate concentrations (B) on cell biomass and amylase production. Con: Control; TP: Tryptone; SC: Soybean cake powder; YE: Yeast extract; MEP: Malt extract powder; CSP: Corn steep powder; SPI: Soy protein isolate; PT: Peptone.
Con:对照;TP:胰蛋白胨;SC:黄豆饼粉;YE:酵母浸膏;MEP:麦芽浸粉;CSP:玉米浆干粉;SPI:大豆分离蛋白;PT:蛋白胨
图选项
2.2.3 无机氮源对菌体量和淀粉酶产量的影响
如图 5A所示,尿素、硝酸钙和硝酸钠不仅抑制菌体生长,也降低了淀粉酶的产量。添加硝酸铵、硫酸铵和氯化铵菌体量有所增加,而且淀粉酶产量较对照组显著增加,可以推测铵根离子可诱导菌体产淀粉酶;氯化铵可以显著增加淀粉酶产量,产量约为对照组的2.0倍。由图 5B可知,菌体生物量和淀粉酶产量均随氯化铵浓度的增加而增加,当氯化铵浓度为3.0 g/L时淀粉酶产量达到最高,因此选择3.0 g/L为最佳氯化铵浓度。
图 5 无机氮种类(A)和氯化铵浓度(B)对菌体量及淀粉酶产量的影响
Figure 5 Effects of inorganic nitrogen sources (A) and NH4Cl concentrations (B) on cell biomass and amylase production. Con: Control; A: Urea; B: Calcium nitrate anhydrous; C: Sodium nitrate; D: Ammonium nitrate; E: Ammonium chloride; F: Ammonium sulfate; G: Ammonium phosphate.
Con:对照;A:尿素;B:硝酸钙;C:硝酸钠;D:硝酸铵;E:氯化铵;F:硫酸铵;G:磷酸氢二铵
图选项
2.2.4 金属离子对菌体量和淀粉酶产量的影响
如图 6A所示,氯化镁、氯化钙、氯化钡可增加淀粉酶产量,其中氯化钙的促进作用最为显著,约为对照组的3.3倍,其原因可能是Ca2+的存在增加了酶的刚性,可使淀粉酶保持稳定的构象[16]。随着氯化钙浓度的增加,淀粉酶产量显著增加,15 mmol/L氯化钙对酶产量的促进效果最佳,当氯化钙浓度大于15 mmol/L时,淀粉酶产量逐渐下降(图 6B)。
图 6 金属离子种类(A)和氯化钙浓度(B)对菌体量及淀粉酶产量的影响
Figure 6 Effects of metal ions (A) and CaCl2 concentrations (B) on cell biomass and amylase production. Con: Control; A: Calcium chloride; B: Manganese sulphate; C: Magnesium chloride; D: Barium chloride; E: Zinc chloride.
Con:对照;A:氯化钙;B:硫酸锰;C:氯化镁;D:氯化钡;E:氯化锌
图选项
2.3 发酵条件优化
2.3.1 发酵温度对菌体量和淀粉酶产量的影响
如图 7A所示:当温度为24−30 ℃时淀粉酶产量较低,这可能与低温条件下菌株生长缓慢相关;当温度为34 ℃时淀粉酶产量达到最高,此时菌体代谢旺盛,致使淀粉酶大量表达。
图 7 发酵温度(A)、发酵液初始pH (B)和接种量(C)对菌体量及淀粉酶产量的影响
Figure 7 Effects of temperature (A), pH (B) and inoculum size (C) on cell biomass and amylase production.
图选项
2.3.2 发酵液初始pH对菌体量和淀粉酶产量的影响
由图 7B可知,pH值增大可促进淀粉酶分泌,当pH值为7.5时产酶量最大;在偏碱性和偏酸性条件下,菌株生长受到抑制,导致淀粉酶表达量低,这与郦金龙等[17]报道一致。
2.3.3 接种量对菌体量和淀粉酶产量的影响
如图 7C所示,接种量在1.0%−6.0%时,淀粉酶产量随接种量的增加而增加,接种量为6.0%时,酶产量达到最大;当接种量大于6.0%,淀粉酶产量随接种量的增加而减少。因此,选择接种量为6.0%为最佳接种量。 2.4 Plackett-Burman试验
Plackett-Burman试验设计及结果如表 1所示。由表 2可知,X2、X4、X6和X7是构建模型的主要影响因素(P < 0.05),因此选取变量X2、X4、X6和X7进一步优化试验。
表 1 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 1 Design matrix and experimental results of Plackett-Burman design
Assay
Variable levels
Amylase activity(U/mL)
X1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
1
−1
1
−1
1
1
−1
1
356.89±2.12
2
−1
−1
1
−1
1
1
−1
831.21±3.68
3
1
1
1
−1
−1
−1
1
716.79±3.18
4
1
−1
−1
−1
1
−1
1
840.79±2.02
5
1
1
−1
−1
−1
1
−1
588.47±3.08
6
−1
1
1
1
−1
−1
−1
428.07±1.56
7
1
1
−1
1
1
1
−1
528.00±4.24
8
−1
1
1
−1
1
1
1
768.32±3.16
9
1
−1
1
1
−1
1
1
832.08±2.02
10
−1
−1
−1
1
−1
1
1
796.99±2.52
11
−1
−1
−1
−1
−1
−1
−1
772.93±2.62
12
1
−1
1
1
1
−1
−1
356.89±2.12
注:X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7分别为麦芽糖、大豆分离蛋白、NH4Cl、pH、接种量、温度和CaCl2 Note:X1, X2, X3, X4, X5, X6 and X7 are maltose, soy protein isolate, NH4Cl, pH, inoculum, temperature and CaCl2 respectively.
表选项
表 2 Plackett-Burman试验显著性分析表
Table 2 Significance analysis of Plackett-Burman experiments
Factors
Variable
Low level
High level
Coefficient
SEa
F-value
P-value
麦芽糖Maltose
X1
6.0
12.0
22.98
12.62
3.32
0.142 7
大豆分离蛋白Soy protein isolate
X2
6.0
12.0
−117.40
12.62
86.56
0.000 7b
NH4Cl
X3
2.0
6.0
30.82
12.62
5.97
0.071 0
pH
X4
6.5
8.5
−59.37
12.62
22.13
0.009 3b
接种量Inoculum size
X5
5.0
7.0
−19.01
12.62
2.27
0.206 5
温度Temperature
X6
32.0
36.0
43.51
12.62
11.89
0.026 1b
CaCl2
X7
11.0
17.0
45.43
12.62
12.96
0.022 8b
注:a:标准误差;b:显著影响因子;R2=0.973 2;RAdj2=0.926 2;RPre2=0.758 5 Note: a: Standard error; b: Significant effect factor; R2=0.973 2; RAdj2=0.926 2; RPre2=0.758 5.
表选项
2.5 最陡爬坡试验
为了逼近X2、X4、X6和X7的最大响应区域,根据表 2设计爬坡方案,如表 3所示。试验组3条件下,淀粉酶产量最高(836.04 U/mL),因此选择试验组3作为中心点。
表 3 最陡爬坡试验设计结果
Table 3 Results of the steepest climb experimental design
Assay
X2 (g/L)
X4
X6 (℃)
X7 (mmol)
Amylase activity (U/mL)
1
12.0
8.5
32
11.0
494.03±1.25
2
10.5
8.0
33
12.5
630.83±2.55
3
9.0
7.5
34
14.0
836.04±3.45
4
7.5
7.0
35
15.5
752.44±2.98
5
6.0
6.5
36
17.0
718.24±1.26
注:X2、X4、X6和X7分别是大豆分离蛋白、pH、温度和CaCl2 Note: X2, X4, X6 and X7 are soy protein isolate, pH, temperature and CaCl2 respectively.
表选项
2.6 Box-Behnken design试验结果
为确定X2、X4、X6和X7的交互作用,进行四因素三水平的响应面实验,试验设计与结果如表 4所示。
表 4 Box-Behnken design试验设计及结果
Table 4 Design matrix and experimental results of Box-Behnken design
Assay
Factors
Amylase activity (U/mL)
X2
X4
X6
X7
Observed
Predicted
1
7.5 (−1)
7.0 (−1)
34 (0)
14 (0)
648.03±5.66
635.95
2
10.5 (1)
7.0 (−1)
34 (0)
14 (0)
720.04±3.77
722.62
3
7.5 (−1)
8.0 (1)
34 (0)
14 (0)
808.04±1.87
807.96
4
10.5 (1)
8.0 (1)
34 (0)
14 (0)
512.03±5.89
526.61
5
9.0 (0)
7.5 (0)
33 (−1)
11 (−1)
632.03±5.66
633.28
6
9.0 (0)
7.5 (0)
35 (1)
11 (−1)
760.04±5.21
756.29
7
9.0 (0)
7.5 (0)
33 (−1)
17 (1)
761.04±3.74
767.29
8
9.0 (0)
7.5 (0)
35 (1)
17 (1)
640.03±5.66
641.28
9
7.5 (−1)
7.5 (0)
34 (0)
11 (−1)
768.04±3.77
765.33
10
10.5 (1)
7.5 (0)
34 (0)
11 (−1)
648.03±5.61
631.99
11
7.5 (−1)
7.5 (0)
34 (0)
17 (1)
728.04±1.87
738.83
12
10.5 (1)
7.5 (0)
34 (0)
17 (1)
680.03±1.47
677.49
13
9.0 (0)
7.0 (−1)
33 (−1)
14 (0)
552.03±5.56
536.16
14
9.0 (0)
8.0 (1)
33 (−1)
14 (0)
808.04±1.41
804.17
15
9.0 (0)
7.0 (−1)
35 (1)
14 (0)
816.04±1.27
814.67
16
9.0 (0)
8.0 (1)
35 (1)
14 (0)
512.03±5.26
522.66
17
7.5 (−1)
7.5 (0)
33 (−1)
14 (0)
584.03±3.35
590.82
18
10.5 (1)
7.5 (0)
33 (−1)
14 (0)
720.04±2.13
725.50
19
7.5 (−1)
7.5 (0)
35 (1)
14 (0)
824.04±3.14
821.33
20
10.5 (1)
7.5 (0)
35 (1)
14 (0)
496.03±5.26
491.99
21
9.0 (0)
7.0 (−1)
34 (0)
11 (−1)
696.04±2.02
718.66
22
9.0 (0)
8.0 (1)
34 (0)
11 (−1)
704.04±1.07
702.66
23
9.0 (0)
7.0 (−1)
34 (0)
17 (1)
720.04±1.17
724.16
24
9.0 (0)
8.0 (1)
34 (0)
17 (1)
736.04±5.16
716.16
25
9.0 (0)
7.5 (0)
34 (0)
14 (0)
960.05±1.57
949.07
26
9.0 (0)
7.5 (0)
34 (0)
14 (0)
936.05±2.22
949.07
27
9.0 (0)
7.5 (0)
34 (0)
14 (0)
944.05±3.14
949.07
28
9.0 (0)
7.5 (0)
34 (0)
14(0)
960.48±4.58
949.07
29
9.0 (0)
7.5 (0)
34 (0)
14 (0)
944.72±1.81
949.07
注:X2、X4、X6和X7分别是大豆分离蛋白、pH、温度和CaCl2Note: X2, X4, X6 and X7 are soy protein isolate, pH, temperature and CaCl2 respectively.
表选项
由表 5可知,模型极显著(P < 0.001),失拟项不显著(P=0.279 2 > 0.05),R2=0.994 8,RAdj2(0.989 5)和RPre2(0.973 6)的差值< 0.02,说明模型预测值与实际值的拟合度较高[18],适用于菌株LT-2发酵产淀粉酶的预测分析[19]。该模型X2、X2X4、X2X6、X4X6、X6X7、X22、X42、X62和X72影响极显著(P < 0.001);考虑显著项,运用Design Expert 10.04进行二次线性回归拟合,得到回归方程:Y=949.07–48.67X2–6.00X4–0.75X6+4.75X7–92.00X2X4–116.01X2X6+18X2X7–140.01X4X6+ 2X4X7–62.26X6X7–143.89X22–131.89X42–147.77X62– 101.77X72。各因素交互作用对淀粉酶产量的响应面和对应等高线图如图 8所示。
表 5 Box-Behnken design试验回归方程和方差分析
Table 5 Experimental regression equations and analysis of variance of Box-Behnken design
Source
SSa
DFb
MSc
F-value
Probe > F
Model
5.08×105
14
3.63×103
189.00
< 0.000 1d
X2
2.84×104
1
2.84×104
148.00
< 0.000 1d
X4
4.32×102
1
4.32×102
23.00
0.155 3
X6
0.68×101
1
0.68×101
350.00
0.853 8
X7
2.71×102
1
2.71×102
14.00
0.254 2
X2X4
3.39×104
1
3.39×104
177.00
< 0.000 1d
X2X6
5.38×104
1
5.38×104
281.00
< 0.000 1d
X2X7
1.30×103
1
1.30×103
68.00
0.020 9
X4X6
7.84×104
1
7.84×104
410.00
< 0.000 1d
X4X7
1.60×101
1
1.60×101
840.00
0.776 8
X6X7
1.55×104
1
1.55×104
81.00
< 0.000 1d
X22
1.34×105
1
1.34×105
701.00
< 0.000 1d
X42
1.13×105
1
1.13×105
589.00
< 0.000 1d
X62
1.42×105
1
1.42×105
740.00
< 0.000 1d
X72
6.72×104
1
6.72×104
351.00
< 0.000 1d
Residual
2.68×103
14
1.91×102
Lack of fit
2.22×103
10
2.22×102
1.91
0.279 2
Pure error
4.64×102
4
1.16×102
Cor total
5.11×105
28
注:X2、X4、X6和X7分别是大豆分离蛋白、pH、温度和CaCl2。a:平方和;b:自由度;c:均方差;d:极显著。R2=0.994 8,RAdj2=0.989 5,RPre2=0.973 6 Note: X2, X4, X6 and X7 are soy protein isolate, pH, temperature and CaCl2, respectively. a: Sum of squares; b: Degrees of freedom; c: Mean squared difference; d: Highly significant. R2=0.994 8, RAdj2=0.989 5, RPre2=0.973 6.
表选项
图 8 各因素交互作用对淀粉酶产量的响应面和对应等高线图
Figure 8 Response surface plot and the corresponding contour showing the interactive effects of various factors on amylase production.
图选项
2.7 产酶最佳条件的确定与验证试验
使用Design Expert 10.04得到模型极值点:大豆分离蛋白8.69 g/L、pH 7.5、温度34.08 ℃、氯化钙13.94 mmol/L,此条件下模型预测最高淀粉酶产量为953.94 U/mL。以此最佳条件进行验证试验,淀粉酶产量为(945.01±2.51) U/mL,是预测值的99.06%,说明该模型可信度较高[20],所得条件可用于菌株LT-2发酵产淀粉酶。 2.8 5 L发酵罐分批发酵产淀粉酶
在最佳发酵参数下,将菌株LT-2分别在5 L发酵罐和500 mL摇瓶中发酵产淀粉酶。试验结果如图 9所示,在摇瓶水平条件下,发酵33 h淀粉酶产量最高为972.88 U/mL,约为发酵条件优化前产量的5.01倍;在发酵罐水平条件下,发酵51 h淀粉酶产量最高为(1 198.40±4.56) U/mL,是优化前淀粉酶产量的6.17倍。虽然发酵罐水平的发酵时间较长,但淀粉酶产量是摇瓶水平的1.23倍。发酵罐水平发酵周期较长的原因可能是种子液接入量不能满足发酵罐扩大培养的需要,也可能是摇瓶与发酵罐的发酵条件不同,导致发酵罐中菌体生长延滞期较长。
图 9 菌株LT-2产淀粉酶发酵进程曲线
Figure 9 Time profile of amylase fermentation by strain LT-2.
图选项
2.9 菌株LT-2淀粉酶水解淀粉
如图 10所示,菌株LT-2所产淀粉酶具有较强的淀粉降解能力。在淀粉酶的催化下,随着时间的推移,淀粉始终保持快速水解状态,当水解时间为12 h时,还原糖浓度达到峰值约为27.5 g/L,淀粉降解速率为6.17×10−5 g/(U·h)。
图 10 菌株LT-2水解淀粉时间曲线
Figure 10 Time profile of hydrolyzing starch by amylase.
图选项
3 讨论与结论
本文分离得到一株高产淀粉酶的细菌,经形态与16S rRNA基因序列鉴定,确定为贝莱斯芽孢杆菌。通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behuken Design试验对其产酶条件进行优化,并探索其淀粉水解能力。 发酵优化结果显示,菌株LT-2在以麦芽糖为碳源、大豆分离蛋白和氯化铵为无机氮源、氯化钙为无机盐、pH 7.5、温度34.08 ℃条件下培养产酶效果最佳。摇瓶水平淀粉酶产量达到972.88 U/mL,发酵罐水平淀粉酶产量达到1 198.40 U/mL,是优化前淀粉酶产量的6.17倍。由表 6可知,菌株LT-2淀粉酶产量是B. velezensis 6-10的7.32倍[21],是B. aryabhattai KIIT BE-1淀粉酶产量的288.46倍[22]。菌株6-10和菌株KIIT BE-1产酶时均以淀粉为碳源,虽然淀粉是淀粉酶的作用底物,但淀粉作为碳源时并未诱导菌株高产淀粉酶[21-22]。菌株LT-2发酵产酶最佳碳源是麦芽糖,当以麦芽糖为唯一碳源发酵淀粉酶的产量约为淀粉作为唯一碳源发酵淀粉酶产量的2.5倍。众所周知,麦芽糖是由2分子葡萄糖经α-1, 4糖苷键连接而成的二糖,由此可以推测菌株LT-2所产淀粉酶能专一水解α-1, 4糖苷键,进一步可以推断麦芽糖可以高效诱导菌株LT-2表达淀粉酶,这一现象与聂晶晶等[26]报道一致。由此可见,菌株LT-2在淀粉酶产量和淀粉酶生产效率上具有明显的优越性。此外,B. velezensis LT-2产淀粉酶速率大于23.50 U/(mL·h),是菌株6-10的生产速率的13.74倍,是菌株MF04的27.97倍。
表 6 不同芽孢杆菌属发酵淀粉酶情况
Table 6 Fermentation of amylases in different Bacillus species
菌株Strains
淀粉酶活力Amylase activity (U/mL)
发酵时间Fermentation time (h)
淀粉酶生产速率Amylase production rate (U/(mL·h))
参考文献References
Bacillus velezensis 6-10
1.64×102
96
1.71
[21]
Bacillus aryabhattai KIIT BE-1
4.16
48
8.70×10–2
[22]
Bacillus sp. Q-164
1.26×102
120
1.05
[23]
Bacillus cereus MF04
6.02×101
72
0.84
[24]
Bacillus subtilis D19
1.30×103
NG
NG
[25]
Bacillus velezensis LT-2
9.72×102
33
28.64
This studya
Bacillus velezensis LT-2
1.20×103
51
23.50
This studyb
注:NG:Not given;a:摇瓶水平;b:发酵罐水平Note: NG: Not given; a: Shake flask level; b: Fermenter level.
表选项
本文所用贝莱斯芽孢杆菌来源于高温酒曲,对酿造环境具有较好的适应性,若将该菌应用于白酒和黄酒等食品发酵行业有望提高粮食利用率并丰富酒体风味,对芽孢杆菌在酿酒工业领域的应用有着重要的实践意义。
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耐高温α-淀粉酶的研究进展
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125
作者:
林必博
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摘要:
耐高温α-淀粉酶是一种重要的工业用酶制剂。本文概述了耐高温α-淀粉酶的酶学性质、产生茵及其高产菌株的选育,介绍了发酵生产以及分离纯化方法方面的研究进展。
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关键词:
耐高温α-淀粉酶
菌株选育
研究进展
DOI:
CNKI:SUN:FJKJ.0.2011-04-020
被引量:
23
年份:
2011
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