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2024-03-07 20:04:12

MTT实验——原理、步骤、注意事项、示例图 - 知乎

MTT实验——原理、步骤、注意事项、示例图 - 知乎切换模式写文章登录/注册MTT实验——原理、步骤、注意事项、示例图指北针天津大学药学硕士一、实验应用1. 细胞增殖测定2. 细胞毒性测定3. 细胞活性测定 (不加样本，没有下述DAY 2步骤2)4. 药物筛选5. 肿瘤放射敏感性测定二、实验原理噻唑蓝，简称MTT。细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 (DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT检测原理三、仪器和试剂1. 仪器：台式离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪 (570nm滤光片)、酶标板振荡器、10μL/100-200μL多通道移液器、生物安全柜等。2. 试剂：MTT检测试剂盒、DMEM或其他培养基、双抗、FBS、PBS、DMSO。四、实验步骤DAY 11. 对前一天培养好的处于对数期的细胞消化、离心、计数。2. 在96孔板上接种100μL 3k-7k/孔的细胞，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养24小时。DAY 21. 在显微镜下观察细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。2. 配制不同浓度梯度的样本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14μM。每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养适当时间长度。如6，12，24或48小时。DAY 3/41. MTT使用前在室温下解冻并离心 (一般MTT检测试剂盒中包含MTT粉末、MTT溶剂和甲臜增溶溶液三种组分，不同厂家的试剂盒可能略有差异。在实验前，需要将MTT溶剂加入到MTT粉末中配制成5mg/mL的MTT溶剂，用不完的可以放-20℃冰箱保存)。2. 用倒置显微镜检测细胞生长状态，并用4X/10X取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔拍照记录。3. 在每孔中加入10μL MTT溶液，使终浓度为0.5mg/mL。4. 在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养4小时。5. 小心地吸取孔中全部上清液，防止单层细胞破裂。6. 每孔加入100μL甲臜增溶溶液。7. 将板子放在振荡器上以300rpm/min震荡10min使甲臜全部溶解。8. 用酶标仪在570nm处测量吸光度。9. 用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。10. 结果示例图：Agyin JK, Breast Cancer Res. 2009;11(5):R74.Ito M, Cell Commun Signal. 2019;17(1):137. Published 2019 Oct 28.五、注意事项1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和细胞达到实验要求的培养时间，这是因为不同的细胞生长速度不同。2. 接种时细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致，最好一人接种，一人辅助混匀。3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基、PBS或水。4. 药物样本初筛时可以适当减少浓度梯度的数量，增大浓度梯度间的倍数。若要确定样本的IC50则需要增加浓度梯度的数量，一般8-12个足矣。若有文献参考，则根据文献设置浓度梯度。5. 加入样本时要注意溶解样本的培养基中血清浓度对样本的影响，部分样本可能受血清影响较大，此时需使用无血清培养基溶解样本。6. 加样本前，要先吸出前面的培养基，但不可长期搁置防止细胞死亡，最好一块板吸完，立即加入配好的不同浓度的样本。7. 溶解样本后最好额外分装一管，以备后续二次实验或因试验操作失误损失一次样本，二次随取随用，也避免样本的反复冻融。8. 板子上要写好标记，板子和板盖都要写上序号，尽量避免写在孔上。9. 加入MTT溶液时需要避光，并且此过程需要大量枪头，尽量提前准备好。10. MTT有致癌性，实验时做好各种防护。11. 用排枪将上清液去除时，不可触碰到底部细胞，可略微将枪头触碰底面并倾斜板身，一次性将上清液全部吸出。12. 为了节省甲臜增溶溶液，可以每次从瓶中倒出一半到加样槽中。13. 设置实验孔 (含有细胞的培养基、MTT、待测物质)阴性对照孔 (含有细胞的培养基、MTT、不含待测物质)阳性对照孔 (含有细胞的培养基、MTT、阳性对照样本)空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基、MTT)14. 实验结果计算公式：细胞存活率=[(实验孔-空白孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%抑制率=[(阴性对照孔-实验孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%六、参考文献[1]Agyin JK, Santhamma B, Nair HB, Roy SS, Tekmal RR. BU-32: a novel proteasome inhibitor for breast cancer. Breast Cancer Res. 2009;11(5):R74. doi:10.1186/bcr2411[2]Ito M, Codony-Servat C, Codony-Servat J, et al. Targeting PKCι-PAK1 signaling pathways in EGFR and KRAS mutant adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma. Cell Commun Signal. 2019;17(1):137. Published 2019 Oct 28. doi:10.1186/s12964-019-0446-z声明：本本章重在分享科研方法、资讯、传播知识。文章不构成任何投资建议，也非临床预防、诊断、治疗建议。未经许可严禁商业性转载，非商业性转载请注明出处。编辑于 2023-11-02 18:00・IP 属地广东细胞实验生物实验药学赞同 82添加评论分享喜欢收藏申请

MTT法_百度百科

_百度百科网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心MTT法播报讨论上传视频检测细胞存活和生长的方法收藏查看我的收藏0有用+10本词条由“科普中国”科学百科词条编写与应用工作项目审核。MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。中文名MTT法外文名MTT assay别名MTT比色法学科生命科学目录1简介2配制方法3实验步骤▪贴壁细胞▪悬浮细胞4缺点5注意事项简介播报编辑MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下,外源性MT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MT结晶形成的量与活细胞数成正比 [1]。配制方法播报编辑MTT法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验步骤播报编辑贴壁细胞1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 1640）。2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD490nm测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔缺点播报编辑由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。注意事项播报编辑MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶 [2]。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调pH 7.4定容1L新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号京公网安备110000020000

MTT实验最全指南 - 实验方法 - 丁香通

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MTT实验最全指南

关键词： mtt实验指南

来源：互联网

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MTT实验最全指南有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选

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一、mtt 是什么

MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

二、MTT法用来做什么

简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

MTT主要有两个用途

1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;

2.细胞增殖及细胞活性测定。

三、为何MTT可以用来做上述工作

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

四、实验所需材料

1.MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g

1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。具休做法：预先在50ml离心管(没有的话，可用培养瓶替代)加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

注意事项：

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感

MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内(个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.

2. MTT甲瓒溶解液

2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。

2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液(文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24(10)：455-457)，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。(个人觉得其溶解的能力不如DMSO强)

该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。

五、MTT法实验步骤

1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

以一般细胞培养常用的25cm2为例，

1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.

3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。

对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液

6. 终止培养，准备溶解结晶。

溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)

2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。

7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

六、MTT结果分析

关于如何计算IC50

1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下

药物浓度ug/ml

100

12.5

6.25

3.125

OD均值

0.080

0.093

0.236

0.374

0.441

0.531

0.614

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

药物浓度ug/ml

100

12.5

6.25

3.125

抑制率

0.869

0.849

0.616

0.391

0.282

0.135

代入计算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186ug/ml

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Assay Protocol to Measure Cytotoxicity

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The MTT assay is used to measure cellular metabolic activity as an indicator of cell viability, proliferation and cytotoxicity. This colorimetric assay is based on the reduction of a yellow tetrazolium salt (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide or MTT) to purple formazan crystals by metabolically active cells (Figure 1).6,7,35 The viable cells contain NAD(P)H-dependent oxidoreductase enzymes which reduce the MTT to formazan.36 The insoluble formazan crystals are dissolved using a solubilization solution and the resulting colored solution is quantified by measuring absorbance at 500-600 nanometers using a multi-well spectrophotometer. The darker the solution, the greater the number of viable, metabolically active cells.

This non-radioactive, colorimetric assay system using MTT was first described by Mosmann, T et al.1 and improved in subsequent years by several other investigators.2-6 The Cell Proliferation Kit I (MTT) is an optimized MTT assay kit containing ready to use reagents, does not need washing steps or additional reagents. It is a quantitative assay that allows rapid and convenient handling of a high number of samples. The Cell Proliferation Kit I (MTT) can be used for multiple applications, such as,

Quantification of cell growth and viability.1,3,5-7

Measurement of cell proliferation in response to growth factors, cytokines and nutrients.1-3,6,8-12 (see figure 3).

Measurement of cytotoxicity. Examples are the quantification of tumor necrosis factor-a or -b effects 13,14 (see figure 2) or macrophage induced cell death15,16 and the assessment of cytotoxic 17-34 or growth inhibiting agents such as inhibitory antibodies.

To study cell activation.4

Figure 1.Metabolism of MTT to a formazan salt by viable cells as shown in a chemical reaction (A) and in a 96-well plate (B).Cell Proliferation Kit I (MTT) Components (Product No. 11465007001)

MTT Reagent

Ready to use, non-sterile

5 vials containing 5 ml MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (1X), at 5 mg/mL in phosphate-buffered saline (PBS, 806552)

Solubilization Solution

1X, ready-to-use

3 bottles with 90 mL

Assay Protocol to Measure Cytotoxicity

Additional Reagents Required:

Culture medium, e.g., RPMI 1640 (R0883) containing 10% heat inactivated FCS (fetal calf serum, 12106C), 2 mM glutamine (G6392) and 1 μg/mL actinomycin C1 (actinomycin D, A9415).

If an antibiotic is to be used, additionally supplement media with penicillin/streptomycin or gentamicin

Tumor necrosis factor-α, human (hTNF-α) (10 μg/mL), sterile (T6674).

Protocol:

For the determination of the cytotoxic effect of human tumor necrosis factor-α (hTNF-α, T6674) on WEHI-164 cells (mouse fibrosarcoma, 87022501) (see Figure 2).

Preincubate WEHI-164 cells at a concentration of 1 × 106 cells/ml in culture medium with 1 μg/mL actinomycin C1 for 3 h at 37 °C and 5-6.5% CO2.

Seed cells at a concentration of 5 × 104 cells/ well in 100 μl culture medium containing 1 μg/ml actinomycin C1 and various amounts of hTNF-α (final concentration e.g., 0.001–0.5 ng/mL) into microplates (tissue culture grade, 96 wells, flat bottom).

Incubate cell cultures for 24 h at +37 °C and 5-6.5% CO2.

After the incubation period, add 10 μl of the MTT labeling reagent (final concentration 0.5 mg/ml) to each well.

Incubate the microplate for 4 h in a humidified atmosphere (e.g., +37 °C, 5-6.5% CO2).

Add 100 μl of the Solubilization solution into each well.

Allow the plate to stand overnight in the incubator in a humidified atmosphere (e.g., +37 °C, 5-6.5% CO2).

Check for complete solubilization of the purple formazan crystals and measure the absorbance of the samples using a microplate (ELISA) reader. The wavelength to measure absorbance of the formazan product is between 550 and 600 nm according to the filters available for the ELISA reader, used. The reference wavelength should be more than 650 nm.

Figure 2.Determination of the cytotoxic activity of recombinant human TNF-α (hTNF-α) on WEHI-164 cells (mouse fibrosarcoma) using MTT assay.Assay Protocol to Measure Cell Growth

Additional Reagents Required

Culture medium (e.g., DMEM, Product No. D5671) containing 10% heat inactivated FCS (fetal calf serum, Product No. 12106C)

2 mM glutamine (Product No. G6392)

0.55 mM L-arginine (Product No. A8094)

0.24 mM L-asparagine-monohydrate (Product No. A4284)

50 μM 2-mercaptoethanol (Product No. M3148),

HT-media supplement (Product No. H0137) (1×), containing 0.1 mM hypoxanthine and 16 μM thymidine. If an antibiotic is to be used, additionally supplement media with penicillin/streptomycin or gentamicin.

Interleukin-6, human (hIL-6, Product No. SRP3096) (200,000 U/mL, 2 μg/mL) sterile

Protocol

For the determination of human interleukin-6 (hIL-6) activity on 7TD1 cells (mouse-mouse hybridoma, DSMZ, ACC 23) (see fig. 3).

Seed 7TD1 cells at a concentration of 2 × 103 cells/well in 100 μL culture medium containing various amounts of IL-6 [final concentration e.g., 0.1-10 U/mL (0.001-0.1 ng/mL)] into microplates (tissue culture grade, 96 wells, flat bottom).

Incubate cell cultures for 4 days at +37 °C and 5-6.5% CO2.

After the incubation period, add 10 μL of the MTT labeling reagent (final concentration 0.5 mg/mL) to each well.

Incubate the microplate for 4 h in a humidified atmosphere (e.g., +37 °C, 5-6.5% CO2).

Add 100 μL of the Solubilization solution into each well.

Allow the plate to stand overnight in the incubator in a humidified atmosphere (e.g., +37 °C, 5-6.5% CO2).

Check for complete solubilization of the purple formazan crystals and measure the spectrophotometrical absorbance of the samples using a microplate (ELISA) reader. The wavelength to measure absorbance of the formazan product is between 550 and 600 nm according to the filters available for the ELISA reader, used. The reference wavelength should be more than 650 nm.

Figure 3.Proliferation of 7TD1 cells (mouse-mouse hybridoma) in response to recombinant human interleukin-6 (hIL-6) using MTT assay.Similar Assays

XTT assay and WST-1 assay can also be used for measuring cell viability and proliferation.

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MTT实验原理、方法、实验步骤 - 黄灿华教授实验室

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MTT实验一、原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。　　缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。二、几种MTT法实验步骤普通MTT法实验步骤： 1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞（细胞浓度的问题见后面的注意事项）接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线药物MTT法实验步骤（1）贴壁细胞：1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4: 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。（2）悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。三、注意事项： (1) 选择适当得细胞接种浓度和培养时间。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以防止细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。因此，很多高手总结出“宁少勿多”的原则，这一原则在大多数情况下是适用的。对于体积大，增殖快的细胞，比如肿瘤细胞，在96孔板中不能接种太多数目的细胞。一般应该少于104个/孔。同时，细胞贴壁后不可培养过久，以防过于密集。大多数肿瘤细胞最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。对于体积小，增殖慢、悬浮的细胞，在96孔板中可以接种更多数目的细胞。甚至可以超过105个/孔。同时，为了观察药物对这类细胞的效果，可以较上一种细胞培养更长时间。在做肿瘤细胞的时候，往往要根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时. (2) 设置调零孔（只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul）。 (3) 设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜）。 (4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。 (5) 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。同时加入pbs液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。 (6)防止药物与MTT反应。如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。 (7) 吸收值分析在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。 (8)培养过程中换液100ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果。如果培养时间长，在48h应该换液一次。 (9) 避免血清干扰高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 (10)判断污染如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。(11)加DMSO前要把液体小心吸掉但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。对于贴壁细胞，可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸。如有错误，请您提出更正；如有遗漏，请您补充。祝您实验顺利！

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重组蛋白

细胞因子

趋化因子

激素

抗体纯化

重组蛋白酶相关

其它重组蛋白

酶及活性检测

蛋白酶

生化酶

酶活性检测

蛋白样品制备

裂解及蛋白抽提

蛋白酶抑制剂

磷酸酶抑制剂

蛋白修饰酶抑制剂

蛋白表达与纯化

原核蛋白表达

蛋白纯化

蛋白修饰与标记

蛋白修饰与去修饰

蛋白标记

蛋白检测

蛋白定量

预制胶

蛋白分子量标准

蛋白电泳

Western检测

免疫沉淀

免疫染色

ELISA

新生蛋白质检测

细胞株

人细胞株

小鼠细胞株

其它种属细胞株

报告基因细胞株

HEK293T基因敲除细胞(库)

过表达稳转细胞株

细胞组织培养

培养液相关

血清

细胞组织消化

原代细胞培养

干细胞培养

内毒素检测与清除

支原体检测与清除

细胞冻存

3D培养

细胞粘附

细胞培养耗材

基因表达调控

细胞转染

病毒感染

人基因编辑慢病毒(库)

细胞样品制备

细胞组分分离

蛋白样品制备

RNA样品制备

DNA样品制备

细胞裂解样品

HEK293T基因敲除细胞RIPA裂解液

HEK293T基因敲除细胞Trizol裂解液

细胞增殖与分化

干细胞检测

细胞增殖

细胞分化

细胞衰老

细胞死亡与自噬

细胞凋亡

细胞坏死

细胞焦亡

自噬

细胞组织染色

普通染色

荧光染色

免疫染色

亚细胞研究

细胞膜

细胞核

线粒体

内质网

高尔基体

溶酶体

外泌体

植物原生质体

信号小分子检测

活性氧相关

一氧化氮相关

代谢小分子相关

钙离子等检测

转录调控

报告基因相关

EMSA相关

核转运

荧光探针

小分子荧光探针

细胞凋亡荧光探针

细胞器荧光探针

其它荧光探针

抗体制备

免疫佐剂

抗体纯化

抗体分析

二抗

HRP标记二抗

Biotin标记二抗

ALP标记二抗

荧光标记二抗

常用一抗

内参抗体

标签抗体

细胞器标志抗体

细胞标志抗体

对照IgG

敲除验证抗体

修饰抗体

荧光标记一抗

HRP标记一抗

IHC抗体

凋亡与自噬

Regulation of Apoptosis

Inhibition of Apoptosis

Death Receptor Signaling

Mitochondrial Control of Apoptosis

Autophagy Signaling

p53 Signaling

细胞代谢

Insulin Signaling

AMPK Signaling

Warburg Effect

Hypoxia Signaling

Glucose metabolism

Fatty Acid Metabolism

Endocrinology & Hormones

Transmembrane Transporters

Glutamine Metabolism

Other Metabolism

染色质/表观遗传/细胞周期

Protein Acetylation

Histone Methylation

DNA Methylation

Crosstalk Between Protein Modifications

G1/S Checkpoint

G2M/DNA Damage Checkpoint

RNA Editing/Splicing

Epigenetics

DNA Damage and Repair

Nuclear Receptor Signaling

Chromatin Regulation

Cell Cycle Related

细胞骨架/细胞外基质

Microtubule Dynamics

Actin Dynamics

Adherens Junction Dynamics

Cytoskeletal Signaling

免疫与炎症

Jak/Stat:IL-6 Signaling

NF-κB Signaling

Toll-Like Receptor Signaling

B Cell Receptor Signaling

T Cell Receptor Signaling

Cytokines

Chemokines

Tumor Necrosis Factors

Anti-infection

Interferons

T-Cell/B-Cell Activation

Macrophages

Complement Activation

Other Immune Pathways

MAPK与PI3K/Akt通路

MAPK/Erk in Growth & Differentiation

MAPK/Erk in GPCR Signaling

SAPK/JNK Signaling

p38 MAPK Signaling

PI3K/Akt Signaling

mTOR Signaling

MAP Kinase Signaling

Protein Tyrosine Kinase Signaling

神经科学

Amyloid & Neurofibrillary Tangles

Dopamine Signaling

Presynaptic Vesicle Transport

Neuronal Signaling

PKC、钙离子及脂信号通路

PKC Signaling

Phospholipid Signaling

Protein Posttranslational Modification

干细胞、发育与分化

Hippo Signaling

ESC Pluripotency and Differentiation

Stem Cell & Lineage Markers

Wnt/β-Catenin Signaling

Notch Signaling

Hedgehog Signaling

TGF-β Signaling

Angiogenesis

蛋白翻译、折叠和降解

Translational Regulation

eIF4E & p70 S6K Pathway

eIF2 Pathway

Ubiquitin/Proteasome

Protein Folding

肿瘤研究

Breast Cancer

Tumor Immunology

其它类别一抗

ErbB/HER Signaling

Organelle Markers

Coagulation

Microbiology

Growth Factors

Transcription Factors

Signal Transduction

Others

化合物库

药物库

天然化合物

凋亡与自噬

Regulation of Apoptosis

Inhibition of Apoptosis

Death Receptor Signaling

Mitochondrial Control of Apoptosis

Autophagy Signaling

细胞代谢

Insulin Signaling

AMPK Signaling

Warburg Effect

Hypoxia Signaling

Glucose Metabolism

Fatty Acid Metabolism

Transmembrane Transporters

染色质/表观遗传/细胞周期

Protein Acetylation

Histone Methylation

Crosstalk Between Protein Modifications

G1/S Checkpoint

G2M/DNA Damage Checkpoint

细胞骨架/细胞外基质

Microtubule Dynamics

Actin Dynamics

Adherens Junction Dynamics

免疫与炎症

Jak/Stat:IL-6 Signaling

NF-κB Signaling

Toll-Like Receptor Signaling

B Cell Receptor Signaling

T Cell Receptor Signaling

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MAPK/Erk in Growth & Differentiation

MAPK/Erk in GPCR Signaling

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p38 MAPK Signaling

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PKC Signaling

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Wnt/β-Catenin Signaling

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蛋白翻译、折叠和降解

Translational Regulation

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这可能是史上最全面的 MTT 大汇总了吧！

来源：丁香园

3573 阅读

这可能是史上最全面的 MTT 大汇总了吧！有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选

前往丁香实验

实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4. 培养时间。200ul 的培养液对于 10 的 4～5 次方的增殖期细胞来说，很难维持 68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在 48 h 换液的。5.MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做 MTT 时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8. 避免血清干扰。用含 15% 胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于 10% 胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul, 铺板使待测细胞调密度至 1000 - 10000 孔，（边缘孔用无菌 PBS 填充）。2.5%CO2，37℃ 孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）, 加入浓度梯度的药物, 原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药. 一般 5 - 7 个梯度, 每孔 100ul, 设 3 - 5 个复孔. 建议设 5 个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37℃ 孵育 16 - 48 小时，倒置显微镜下观察。4. 每孔加入 20ulMTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2 - 3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。6. 每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1×106 /ml，按次序将①补足的 1640（无血清）培养基 40ul ；②加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10 - 1:20)；③需检测物 10ul；④细胞悬液 50ul（即 5×104cell/孔），共 100ul 加入到 96 孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 100(储存液 100 1640）。2）置 37℃，5%CO2 孵育 16 - 48 小时，倒置显微镜下观察。3）每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。（悬浮细胞推荐使用 WST- 1，培养 4 h 后可跳过步骤 4），直接酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000 转 x10 min），小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值。5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。MTT 的配制MTT 一般最好现用现配，过滤后 4ºC 避光保存两周内有效，或配制成 5 mg/ml 保存在- 20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多, 尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT 有致癌性，用的时候小心, 有条件最好带那种透明的簿膜手套. 配成的 MTT 需要无菌，MTT 对菌很敏感；往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制 MTT 时用用 PBS 溶解, 也有人用生理盐水配，60℃ 水浴助溶。PBS 配方:Nacl 8 gKcl 0.2 gNa2 HPO4 1.44 gKH2PO4 0.24 g调 ph 7.4定容 1L关于细胞的接种 (铺板)细胞过了 30 代以后就不要用了, 因为状态不好了; 培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在 10000 /ml 左右时，所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而 MTT 细胞密度多采用 10000 /ml，100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定. 如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105, 贴壁细胞可为 103 - 104.其它的声音：1. 首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔 1000 个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000 /孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT 方法也是表现不出的，最佳点板浓度在 4000 - 5000 /孔，太少的话 SD 值会很大。2.MTT 本身就是比较粗的实验，增殖率 10% 左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20% 的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。3. 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验, 这种细胞长的很快一开始我是用 100000 /ML 的浓度来接种的, 结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系. 后来调整浓度, 用过 40000～80000 /ML 的浓度都做过 MTT 实验, 结果发现做的结果比较好点的是 60000～70000 /ML 的浓度组的. 用 40000 /M 的浓度的组, 由于细胞少, 药物作用的梯度还是有, 只是没有很好的线性关系. 还有根据细胞生长速度以及药物的特性 (有时间依赖性和浓度依赖性的药物) 来确定培养时间是 48 小时还是 72 小时.注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV 会在 8% 左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3 到 4 倍，可能比较容易混匀。10 ml 的离心管里面最好装 3～4 ml 的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。。2. 吸管的吸液量最好在 1 ml 左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量 1 ml 多的吸管，总液量在 5 ml 左右为益3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。4. 吹打次数 100 左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 30－50 次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次，每吹打 3 次后qiang头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）5. 向每孔中用*头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于*头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左 3 下，向右 3 下，在往返回复 3 下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是 MTT 实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。加入 MTT个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT 的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确定，我认为 MTT 多加一些比少加好一些MTT 的量各家报道不同，一般是过量的，所以 10ul 即够了。如果不使用 96 孔板，培养基超过 100ul，MTT 按照 10% 的比例加入. 加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀，不过这个应该关系不大。如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大, 另外 MTT 稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜. 且在加 MTT 前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和 MTT 加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加 MTT 即可。

如何清除上清百家争鸣：1. 加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心 96 孔板，2000r，5 分钟，然后吸掉上清 (如果是悬浮细胞，则推荐此法, 悬浮细胞要离心 2500rpm×10 min. 且其做 MTT 最好用圆底型 96 孔板, 清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉, 建议各孔吸弃 150 - 160ul 即可)。2. 我每次将 MTT 加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心 1000 G,5 min。但是用*小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！3. 另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3 次，比用「吸」的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入ＭＴＴ后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。4. 做 MTT 时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响 OD 值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。5. 加完 MTT 反应 3－4 h 后，从培养箱取出 96 孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶, 使其滑落. 你可以试着将 96 孔板倾斜 30 度角，然后用*尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用*头吸，*尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让*头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。6. 用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次 MTT 我用 1 ml 针头仔细吸培养液, 觉得比其它方法可靠, 一般不会吸走紫色结晶.避免清除上清而改进的方法由于一般可离心 96 孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做 MTT 时，用 DMSO 溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。解决方法 1: 用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良 MTT 方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455 - 457具体方法：

配三联溶解液：10%SDS，5% 异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解。

三联溶解液：SDS10 g，异丁醇 5 ml，10M HCl 0.1 ml 用双蒸水溶解配成 100 ml 溶液操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul/孔；如需给药，则再于同时 (悬浮细胞) 或 4 h 后 (贴壁细胞) 加入不同浓度的药物 10ul/孔，均设三复孔。另外，每块板上另没一个调零孔 (只加培养液，不含细胞和药物)。培养 2d 后，加入 MTT 溶液 20ul/孔，继续培养 4 h，然后加入上述三联液 100ul/孔，于 37 度放置过夜后，用酶标仪测各孔 A570 值。优点：简化操作，提高了可靠性。解决方法 2：日本同仁有一种新试剂 CCK- 8 试剂， CCK- 8 试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有 WST–8[其化学名称为：2 -(2 -甲氧基- 4 -硝基苯基)- 3 -(4 -硝基苯基)- 5 -(2,4 -二磺酸苯)- 2 H-四唑单钠盐]，它在电子载体 1 -甲氧基- 5 -甲基吩嗪硫酸二甲酯（1 -Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料（Formazan dye）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK- 8 试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK- 8 试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。★优点1、简便只需一步即可得到结果2、省时毋需预制，即开即用3、安全毋需放射性同位素和有机溶剂4、快速省去了溶解除沉操作5、灵敏度高灵敏度高于 MTT6、重现性好步骤少；无损失；结果准确就是比较贵，如果经费充足，用这个是不错的。★进行细胞增殖分析的使用方法:1、接种细胞悬液 100μl 于 96 孔板内，预先置于 37℃，5% CO 2 饱和湿度培养箱内培养。2、在每个孔内加入 10μl 的 CCK- 8 试剂。3、把培养板放在培养箱内培养 1 - 4 小时*。4、在 450nm 波长处测定吸光度，参比波长为 600nm 或 600nm 以上。解决方法 3：使用 MTS解决方法 4：加入 DMSO在同一批实验中最好不要更换 DMSO。加 DMSO 前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加 DMSO，一是沉淀会很难溶解. 二培养液的颜色在检测时也能被测到, 会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差, 所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO 的量也可为 100ul 或 150ul.1. 加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5－10 min, 时间控制尽量严格一点, 放置时间长了会影响结果, 值会偏大, 且结果不可信.2. 加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。3. 或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶。振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡 96 孔板有专的振荡器，目的: 扎破气泡. 有气泡存在时, 由于其对光的反射与折射作用 (酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度), 会导致结果偏移.OD 值的测定至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值, 而 ATCC 公司的 MTT 试剂盒用的不是 DMSO，它的测定波长是 570。(就如 ELISA 实验选用 OPD 作底物测定波长是 492，选用 TMB 显色液则用 450); 而对于 SDS 和酸化异丙醇，则选用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长。DMSO 溶后 10 分钟内测，越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD 值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染, 空白孔的 OD 值太高，很可能是细菌污染。复孔直接的 OD 值差别一般应在 0.1－0.15，差别太大考虑：1. 接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔 1000－10000 个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2. 贴壁时间：18－24 h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。一般为了实验的准确，每个浓度可以设 5－6 个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加 MTT 液是否准确，在 37℃，5% 二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4 小时）等有密切的关系，当然测定 OD 值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热 20 min)。MTT 方法的吸收度在 0.2～0.8 之间误差较小。这和分析化学中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer 定律有关，对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比 T 在 15%～65% 之间，或使吸光度 A 在 0.2～0.8 之间，才能保证测量的相对误差较小。当 A = 0.434(或透射比 T = 36.8%) 时，测量的相对误差最小。其它的声音：1. 最好用 570nm 波长的滤光片，因为 MTT 在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是 490nm，但我的经验灵敏度降低一半。2. 我们用的 BIO-TEK 公司的 ELx800, 一般值在 2 以下都是可靠的, 如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差. 我曾经看到园子的有些帖子报道说 OD 值大概在 0.2 - 1.2 范围内与活细胞数有较好的线性关系，但 OD 值在 0.3 - 0.9 范围内可能更佳，若你的 OD 值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。边缘效应96 孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低,96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。解决方法: 将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS 或者培养液，只要能防止蒸发就可以.关于如何计算 IC50(1) 改良寇式法:lgIC50 = Xm-I(P-(3 -Pm-Pn)/ 4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P: 阳性反应率之和Pm: 最大阳性反应率Pn: 最小阳性反应率举个例子：各组浓度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为 10，最大浓度为 0.1，抑制率为 0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm = 0.95Pn = 0.06P = 0.95 + 0.80 + 0.65 + 0.43 + 0.21 + 0.06 = 3.1Xm = lg0.1 =- 1lgI = lg0.1 / 0.01 = 1lgIC50 =- 1 - 1 *(3.1 -(3 - 0.95 - 0.06)/ 4)=- 3.6025IC50 = 0.00025(2)Bliss 法: 自己查阅书籍(3)IC50 计算软件，见下面附件（4）自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！（5）在线求 IC50 或 EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm结果统计学处理所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求 IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%= OD 对照组-OD 实验组/OD 对照组excel 表中可以做两两比较的 T-test, 这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的 T-test，方差分析也可。用的软件是 SPSS 或者 SAS。孔板的重复利用:培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过 3 次, 底值最好在测得值的 1 / 3 一下。强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一, 则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.重复利用时做法 1：洗净后用 2%NaoH 浸泡 4 小时，再用 1% 稀盐酸浸泡 4 小时，冲洗 15 遍，蒸馏水冲洗 3 遍，烘干，UV 照射过夜 (紫外 2 小时以上消毒即可)做法 2:泡酸 2－4 小时，老师让我们别超过 4 小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴 60 照射消毒.做法 3:1. 做完ＭＴＴ后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2. 用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3. 重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液 (六小时以上即可) 后自来水洗净（20 次左右）每个孔都要处理 4. 用去离子水冲洗 3 遍，双蒸水冲洗 3 遍，烤干 5. 超净台中紫外线照射 2 个小时左右，就可以用了，不可以高压。做法 4:1、测完值的 96 孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超 10 - 30 分钟，晾干 (或烘干) 备用。此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。2、每孔加入 50 - 100ul 的胰酶 (0.05%)，我一般加 60ul，加完胰酶后水平振荡 96 孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将 96 孔板放到 37 度培养箱内 (胰酶在 37 度时的活力最大)。对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干 (或烘干) 备用。如果不烘干就泡酸，那么 96 孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。4、将晾干的 96 孔板泡酸 (中强酸) 过夜，捞起后自来水下冲洗 10 遍；双蒸水冲洗 3 遍。三蒸水冲洗 3 遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的 OD 值的测定。5、做实验前，96 孔板至少在紫外灯下照射 30 分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。注：1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出 96 孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触 96 孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。

2、96 孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次 96 孔板的值 (此值为初值)，实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。

文章来源：丁香园@ftfsunny

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细胞增殖检测：MTT法 - 知乎

细胞增殖检测：MTT法 - 知乎切换模式写文章登录/注册细胞增殖检测：MTT法墨鱼丸子一个有跨专业读研经历的职场学姐 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。一、步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。2、培养细胞同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3、呈色培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。二、注意事项1、选择适当得细胞接种浓度。2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！三、举例各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025IC50=0.00025有一个公式可供参考；lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）Xm：lg 最大剂量I：lg（最大剂量/相临剂量）P：阳性反应率之和Pm：最大阳性反应率Pn：最小阳性反应率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率例：用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。MTT法心得 MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。一、MTT的原理活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。二、MTT法检测细胞增殖实验的注意事项1、培养好细胞点板养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上http://www.atcc.org检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的。自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48h能基本长满板底，假设50微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大！2、点板布局其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为%26ldquo;边缘效应%26rdquo;这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。3、加MTT 如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。4、加入MTT后的反应时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。5、检测MTT 还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。6、吸收值分析在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。7、建议如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。发布于 2022-03-07 09:11细胞细胞增殖实验赞同 16添加评论分享喜欢收藏申请

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