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WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎

WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎切换模式写文章登录/注册WB的无敌战神之路——封闭PTMBio景杰生物WB做得好，导师捡到宝。对于刚入实验室的热血青铜宝宝，WB可谓处处都是轰炸区，一个不小心，分分钟落地成盒。为了帮助大家快速get变强秘籍，提升吃鸡率，我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章，助力各位早日成为实验室MVP，进阶WB无敌战神。在上一期的分享中，我们介绍了如何湿转 (WB的无敌战神之路——转膜)，今天将接着介绍封闭，我们开始吧～封闭的目的：蛋白通过非共价作用力吸附于膜表面，但是膜上很多位置并未吸附蛋白，封闭液中的蛋白成分可以与膜表面的空白位置结合，从而避免一抗的非特异性结合，产生非特异条带或者背景杂乱。01|封闭液的选择正确的封闭液可以促使抗原抗体更好的结合。对于封闭液的选择，可以通过抗体说明书确定有无特殊的封闭方法，也可根据实验结果进行相应调整。小编在这里给大家总结了常见的封闭液以及它们的优缺点。Ⅰ 脱脂奶粉脱脂奶粉成分复杂，含有多种蛋白，封闭全面。大部分情况下，脱脂奶粉是首选的封闭液 (浓度2.5-5% w/v)，经济实惠，可以达到较好的封闭效果。但因含少量残留的生物素和碱性磷酸酶 (AP)，它不适用于生物素标记和AP标记的抗体系统。脱脂牛奶也不适用于磷酸化蛋白的检测分析，因为奶粉中含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会导致抗体的非特异性结合，使条带背景变脏。Ⅱ 牛血清白蛋白 (BSA)脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白的封闭，分析磷酸化蛋白理论上要用BSA (浓度2-5 % w/v)。WB结果显示，相较于脱脂奶粉，BSA更适用于磷酸化蛋白的检测。遥想当年，我还不知道磷酸化蛋白封闭需要用BSA，一个磷酸化蛋白我整整跑了一个月，总是背景高，血的教训哪！虽然BSA成分单一，但普通级别的BSA可能含有IgG或其他血清蛋白，这些蛋白会与哺乳动物抗体 (如抗牛、山羊、绵羊、马等二抗) 产生交叉反应，增加非特异性背景信号，因此建议使用不含IgG的BSA产品。相对于脱脂奶粉，BSA不含生物素，对于生物素标记的抗体系统而言，可能BSA是最好的选择。Ⅲ 血清血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭。但与BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应，增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵，需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。Ⅳ 明胶明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。Ⅴ 混合封闭液有研究表明[1]，混合型液封闭效果 (脱脂奶粉+BSA+FBS+明胶) “秒杀”前四种封闭液。如图1所示，不难看出，混合型封闭液的封闭效果最好，信号最强 (该实验使用的是HRP标记的抗体系统)。图1 不同的封闭液对高分子量蛋白CFTR表达的影响/Nitrocellulose：NC膜；FBS：胎牛血清；Gelatin：明胶；Blotto：脱脂奶粉；Mixture：混合液Ⅵ 酪蛋白相对于AP标记二抗，HRP标记二抗灵敏度更高，酶促反应更快。绝大多数实验室用的都是HRP标记二抗。如果有实验室用的是AP标记二抗，小编建议用1 % w/v的酪蛋白进行封闭。酪蛋白在中性和碱性条件下带有负电，会与带正点的膜相互作用，可以用于AP标记的抗体检测系统，缺点是溶解性相对较差~02|封闭的流程01、转膜结束前30 min，以TBST为缓冲体系 (配方见文末) 配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；02、转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温摇动孵育1-2 h，也可以4 ℃冰箱孵育过夜。03|问题解析WB的结果不理想有很多原因，下面我们就分析一下封闭可能会导致的问题吧～1. 条带上有黑色斑点奶粉未完全溶解。出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解，建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀，或溶解后离心取上清液使用。图2 条带上有黑色斑点2. 条带背景高封闭时间过短。封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合，从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合，背景变脏，可以增加封闭时间，或提高封闭液浓度。图3 条带背景高3. 条带信号弱过度封闭。条带信号弱，可以适当降低封闭液浓度，或者更换封闭液，封闭时间如果过长也可以考虑降低，但如果原本时间是1 h，不建议再缩短时间。但封闭过度很少见，条带信号弱可能要优先考虑其他条件，比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。 图4 条带信号弱04|TBST配方发布于 2023-02-16 11:05・IP 属地浙江科学实验​赞同 28​​14 条评论​分享​喜欢​收藏​申请

全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。 - 知乎

全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。 - 知乎首发于Western blot踩雷和制作大全切换模式写文章登录/注册全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。聊点学术AI病理+量化病理方案设计上上期，我在自己的公众号推出了Western blot(WB)最全避雷手册，反响不错。同时，有人在公众号后台私信我，说他(她)的朋友最近被WB烦的不行，希望能够再出几期，解答他们在WB中遇到的难题。个人思考后觉得，应该从WB原理开始，一步一步捋下来，所谓知其然而知其所以然。让我们红尘作伴，共同努力，驾驭WB实验。Western blot可大致分为以下7步，分别是蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、电转印、封闭、抗原-抗体免疫反应、蛋白检测。为此，我将从头到尾剖析WB原理，希望为大家答疑一二。WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。一、蛋白提取常规的样品无外乎3种，分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解，细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来，随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。同时，裂解液中还包含其它成分，如Tris-Hcl作为缓冲剂，可防止蛋白在提取过程中变性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司生产的裂解液成分大同小异，多是以上成分按不同比例组成，可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。最重要的是我们要清楚自己研究的蛋白到底在细胞哪里表达，是细胞膜、胞浆还是细胞核。这决定我们该使用哪种强度的裂解液。如果裂解不充分，我们抽提的总蛋白中可能已经不包括目标蛋白或目标蛋白随着沉淀物被丢弃，那么整个WB实验从一开始就悄无声息地失败了。二、蛋白定量为什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比较同样细胞数量的细胞或同等重量的动物组织中目的蛋白的表达量高低变化。那么首先，我们需要控制样品本身重量大小或细胞数量的多少对实验结果的影响，故不同组间的样本需要控制一致才能提取蛋白。因此，在第一步中提取的蛋白上清液即是同等质量下，同样提取方法下，抽提的总蛋白混合物，这里面包含了各种各样的蛋白。我们必须知道这个上清液中的总蛋白浓度，才能在第三步电泳时保证每一个上样孔中加入的总蛋白质量一致，这样后面对条带上的蛋白定量分析才是有意义的。我们怎样才能知道这个上清液中，总蛋白的浓度呢？目前有4种方法，分别是双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。较常用的是BCA法，其原理：蛋白质可在碱性环境下将2价铜离子还原为1价铜离子，而1价铜离子可以与BCA试剂发生颜色反应，2分子的BCA螯合后可形成紫色的复合物，这种复合物具有非常好的吸光性(用OD值反应)。在562nm的紫外光下，溶液中复合物的OD值与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。我们可以通过这种线性关系大致地计算出自己的样品中总蛋白浓度。自然而然，我们需要一个OD值-蛋白浓度标准曲线。购买商用的蛋白标准品(即包含已知浓度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三种。首先，按照(铜离子体积：BCA regent体积=1：50)配制BCA工作液。准备好4mg/ml蛋白标准品，使用去离子水倍比稀释蛋白标准品，最后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8个不同浓度的蛋白溶液，单位μg/μl。随后将自己的要测的样品按照一定倍数稀释(因为待测样品的蛋白浓度肯定是过高而超过BCA检测的线性范围，稀释倍数根据样本类型和经验来定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待测样品(一个孔一个样品，如待测样品数量为15，则一共使用标准蛋白梯度浓度的8个孔+15=23个孔，个人建议每个孔做2个复孔，防止加样误差)。随后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使发生紫色螯合反应。孵育结束后立刻拿到酶标仪中，在562nm光下，测算每一个孔的OD值，并通过标准蛋白梯度浓度和其相应的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白浓度线性公式(R方值建议0.99以或以上)；同时根据待测样品的OD值和上述公式计算出每一份样品中总蛋白的浓度。定量好的蛋白根据体积比例加入5X或者1X的蛋白上样缓冲液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分变性，解除二级或三级结构，只保留一级链式结构。上样缓冲液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异；DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构；甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；溴酚蓝为小分子蓝色物质，有指示作用。三、SDS-PAGE电泳终于到了电泳时刻。电泳是为了使得我们的加样孔中同等质量的总蛋白在相同电场作用下，从配置好的凝胶中由上往下迁移。我们都学过物理，知道带电物体在电场中移动距离与物体本身的电荷、物体的质量相关。蛋白质本身的电荷、质量、结构是不同的，这些都是影响蛋白在凝胶中移动的因素。通过煮沸，我们消除让蛋白仅保留了一级结构；上一步添加的上样缓冲液中SDS消除蛋白质本身电荷的差异。那么此时，上样的总蛋白中各种各样蛋白在凝胶中的迁移距离只与蛋白的质量相关。电泳时，整个凝胶处在一个大致呈“U”型的电场中，因此市场能看到电场强度过高时，整条溴酚蓝呈现微笑的形状。借助电泳时的电场力作用，首先总蛋白在较小电压下移动到浓缩胶和分离胶的交界处，此时见溴酚蓝呈现一条笔直的蓝线；随后，在高电压的作用下，所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移，一定时间后，总蛋白中各种蛋白会在分离胶中的不同位置中分离开，分离后蛋白所处的水平位置只与蛋白分子量大小有关。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚蓝则在最下面的位置。每一种分子量的蛋白会在分离胶中形成一条直线，当然我们是看不见这条线的，这也是为什么我们要加溴酚蓝的目的，溴酚蓝刚好跑出最下方玻璃板时，电泳就可以停止了，否则你关注的小分子量蛋白可能会跑出胶外。我们可以通过彩色的Marker来大致地确定目标蛋白在哪里。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。四、电转印电转印就是将凝胶中的蛋白，转移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔，都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化)，易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转印。电转时，电场是垂直于我们的凝胶和膜的。因此凝胶中的蛋白质再次在电场作用下向紧贴着凝胶的膜上转移，并最终被吸附在膜的表面。我们可以通过丽春红染色大致地评价电转印的情况(丽春红可将膜上调的蛋白染成红色，而膜其它位置基本不着色)，但是丽春红染色仅仅是粗糙的评价方法，并不是我们的目标蛋白是否转移到膜上的直接证据，做＞150KD分子量蛋白的同志们尤其得注意。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。五、封闭一旦电转印结束，我们就开始了封闭的过程，常采用5%、8%的脱脂奶粉或胎牛血清，室温下，摇床孵育膜1h。常规采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用胎牛血清封闭，因为奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景。为什么要封闭呢？我们知道，电转后蛋白质已迁移至膜的表面，此时膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔。此时我们采用牛奶或胎牛血清封闭，其中包含大量的蛋白质，这些蛋白质会吸附在那些小孔上，堵住这些孔。如果没有封闭，那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置，且很难洗掉，最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等，浪费抗体不说，还会影响最终的判断。当然，这些奶粉中的蛋白也会一定程度地吸附到目标蛋白表面，但是抗原-抗体特异性反应相比，这种非特异性的结合会很轻松的在后面漂洗步骤中消除。有时候也会遇到未封闭，但没有出现杂带。对此，我只想说，常在河边走，哪有不湿鞋啊。六、抗原-抗体免疫反应这一步是比较简单的。就是你购买的特异性抗体与你的目标蛋白发生抗原-抗体特异性免疫反应。首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合，而膜表面其它位置的孔因为被封闭过程中牛奶的蛋白质说填满，因此结合量很少，后面漂洗时可去除。比较重要的是一抗孵育温度和时间，最常用的条件是4℃摇床过夜孵育，温度适宜，分子运动温和。有人也用37℃孵育1-2h，可能会成功，但是温度越高，分子间的运动越激烈，那么出现非特异性杂带的可能性就越高；同时孵育时间较短，也可能会导致一抗与目标蛋白结合不充分。当然，如果你使用的是多克隆抗体，那情况就更难说了，参考上上期避雷手册。一抗结合之后，就是采用的二抗，二抗可与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，该底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。总之，选好自己的一抗是很重要的。特异性高的一抗，WB你怎么做都能出；特异性差的抗体，WB发明人都不一定做得出来。建议不要省钱买国产抗体，你懂得。买抗体之前，看看近年发的高分文章，查查他们用的什么哪个公司抗体。如果找不到参考，一定要买经过该抗体公司敲除验证过的抗体。七、蛋白检测前几步，我们几乎无法看到膜上有啥变化，条带也看不见在哪，反正就是一直将膜洗洗涮涮。终于到了蛋白检测，这也是WB最后一步，终于可以一睹蛋白条带的真容了。蛋白检测包括DAB法和ECL发光法。DAB法就是和免疫组化染色类似，出现的条带在肉眼下即可见，呈现棕黄色，条带可保存1-2年，但是现在用的较少。目前较多采用的是ECL化学发光法，ECL工作液包括鲁米诺(是的，就是我们在刑侦节目案发现场看血迹的东西)和过氧化物，二者避光保存，现配现用(1：1配制)，用时滴在膜上就行，目标条带将在黑暗环境下发出荧光，荧光会进一步胶片上曝光，荧光越强则胶片上曝光的条带越黑，最后洗出胶片即可。现在还有凝胶成像仪可以使用，省去了胶片曝光和洗胶片的步骤，方便而高效，再也不用去小黑屋待着发光了。至于胶片上的黑色条带该怎么分析，这又是另外一个话题了，今后会和大家再聊一聊。终于敲完了，已秃......欲知更多科研技能，请搜索微信公众号“聊点学术”。发布于 2020-03-18 15:17分子生物学实验医学科研​赞同 1266​​63 条评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​文章被以下专栏收录Western blot踩雷和制作大全临床医生

蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤 - 知乎

蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤 - 知乎首发于细胞生物切换模式写文章登录/注册蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤岚solo原理：蛋白免疫印迹（ Western Blot，WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本SOP包括Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成 WB。一、蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备二、 电泳1 PAGE 胶的制备2 蛋白分子量 Marker3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳三、 转膜与显色（ Western Blot）1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测：丽春红4 膜的封闭5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色四、常见问题分析与解决方案五、试剂及缓冲液配方一、蛋白样本提取制备蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。蛋白提取总体原则与注意事项包括：1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。1-1 细胞或组织裂解1-1-1 细胞裂解1. 培养的细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次；2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液（使用前裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂）(0.1 ml /10６ cells)；结合不同培养板及实际细胞数量级及参照下表加入相应量裂解液： 面积（cm2）细胞量（个）裂解液量（μl）96 孔培养板0.320.4-1.0×10520-5024 孔培养板20.3-0.6×10630-6012 孔培养板4.50.6-1.2×10660-1206 孔培养板9.61.2-2.5×106120-2503.5 cm 培养皿81.0-2.0×106100-2006 cm 培养皿212.5-5.0×106250-50010 cm 培养皿550.7-1.5×107700-150025cm2 培养瓶253.0-6.0×106300-60075cm2 培养瓶751.0-2.0×1071000-20003. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的离心管中；不能用细胞刮子刮取的情况可直接冰上裂解30min后用枪多次吹打至细胞完全裂解；4. 4℃摇动 30 min；5. 4℃离心 12000 rpm，20 min；6. 轻轻吸取上清，转移至新预冷的离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。7. 目的蛋白非细胞外基质（ECM）或对胰酶不敏感时也可以采用胰酶消化法收集细胞（即细胞吸去培养基，PBS 漂洗 2 次，加入胰酶消化至脱落，加入预冷的PBS，移入预冷的EP管，离心收集细胞，加入预冷裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），依次按上面4，5，6步骤处理。1-1-2 组织裂解1. 用预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；2. 将组织块放在圆底的微量离心管或 EP管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；3. 每约10 mg组织加入约200 μl 预冷的裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），冰浴匀浆后置于4℃摇动2h，裂解液体积与组织样本量有适当比例（最终的蛋白浓度至少达到1 mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).4. 4℃离心 12000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。1-2蛋白酶抑制剂本实验室使用的蛋白酶抑制剂为PMSF，抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）。在水液体溶液中不稳定，30min就会降解一半，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。工作浓度一般用1mM，1:100(V/V)加入贮液（100mM PMSF），样品处理超过1h，补加一次。PMSF剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作．PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。除PMSF外，裂解液中还需加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（做磷酸化蛋白时必须加），推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或 COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：1）. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液；2）. 用盐酸HCl 调至pH 9.0；3）. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发；4）. 冷却至室温；5）. 再调pH 至 9.0；6）. 再煮沸至无色；7）. 重复上述过程，直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0；8）. 用水定容至原体积；9）. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用。1-3 蛋白定量BCA 法以牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将 Cu2+ 还原成 Cu1+， BCA（Bicinchoninic 酸）螯合 Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色并在 562 nm 有吸收峰，单价 Cu1+ 与蛋白呈剂量相关性，灵敏性很高，试管法可测范围 20-2000 μg/ml，微孔法为 0.5-10μg/ml。不易受一般浓度去污剂的干扰。可耐受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响，40min内抗干扰能力强。BCA测定方法如下：1) 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：孔号01234567蛋白标准溶液（μL）01234567去离子水（μL）2019181716151413对应蛋白含量（μg）051015202530352) 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3) 各孔加入 200μL BCA 工作液；4) 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 min，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5) 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37℃放置 30 min后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值；6) 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。1-4 电泳上样样品的准备1-4-1变性、还原蛋白样本一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸5 min，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 min，本实验室的 上样 buffer 称为5×SDS凝胶还原型加样缓冲液，上样时与样本1：4混合后变性上样即可。SDS是阴离子去污剂、变性剂。氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，蛋白质-SDS 胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异，SDS与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。1-4-2 天然和非还原样本某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，即loading buffer 和电泳液中不加入β-巯基乙醇和或DTT。data-draft-type="table" data-size="normal" data-row-style="normal">蛋白状态凝胶状态loading buffer电泳缓冲液还原—变性还原和变性有β-巯基乙醇或DTT ，有SDS有 SDS还原—天然还原和非变性有β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS氧化-变性非还原和变性无β-巯基乙醇或DTT ，有 SDS有 SDS氧化-还原非还原和天然无β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳二、 电泳SDS-PAGE基本原理：1）. SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。2）. 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。3）. 蛋白质分子结合 SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。2-1 PAGE胶的制备聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称 Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称 Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素 AP）和加速剂（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化（AP-TEMED）和光化学催化（核黄素-TMTED）体系。PAGE胶分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续电泳 作用缓冲液 PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8 Tris-HCl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8 Tris-HCl高，根据蛋白大小不连续系统的浓缩效应：凝胶层的不连续性：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。缓冲液离子成分和pH的不连续性：HCl易解离出Cl- ，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH6.8 的缓冲液中解离度很小，仅为 0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。蛋白质均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离 子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。根据SDS聚丙烯酰胺的有效分离范围选择分离胶浓度。SDS-PAGE胶有效分离范围聚丙烯酰胺胶浓度%线性分离范围/kDa557-2127.536-941020-801212-601510-43分离胶的配置：将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘划线，指示灌胶位置，拔去梳子。在分离胶的配置烧杯中按配方加料，混匀后利用移液器将分离胶(避免气泡产生)滴入二块玻璃板之间，至液面达到梳子下缘1cm 处。用移液器缓慢加入饱和正丁醇或水，注意不要冲乱胶面。静置，待分离胶聚合后，倒去或用滤纸吸去水层。浓缩胶的配制：在浓缩胶的配置烧杯中按配比加料，混匀后即刻用移液器加浓缩胶(避免气泡产生)覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满，轻轻插入梳子（插入梳子时一边倾斜直至全部插入，防止产生气泡）。静置待其凝结后，即制成凝胶板。凝胶制成后最少需放置2h或最好湿盒过夜后才能使用，保证交联反应完全。2-2 蛋白分子量 Marker预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。2-3阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性、特别是一抗的质量和效率。建议使用对照，可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提对照样本。2-4 内参对照管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照必须设立。内参名称分子量大小适用范围β-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40 kDa胞浆和全细胞Tubulin55 kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31 kDa线粒体COXIV16 kDa线粒体Lanin B166 kDa细胞核（不适于去除核膜的样本）TBP38 kDa细胞核（不适于去除DNA的样本）2-5上样电泳蛋白抗原上样量为30 ug。根据样品量选择SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度，一般0.75mm间隙15孔的上样量 < 15uL/孔，1mm间隙10孔的上样量 < 30ul/孔。上样：将二块玻璃板制成的凝胶板子上的夹子卸去，将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。按要求加入电泳缓冲液，使分别加入在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。取处理后的样品液，用微量进样器吸取适量样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)。注意不要冲散样品。电泳：用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源将将电压调到80v（一般15min左右），而在溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，将电压调到120v至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。三、 转膜与显色3-1胶中蛋白的检测电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用锌染（负染）、胶染（blue silver）或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的锌染法，否则可以采用不可逆考马斯亮蓝法染色。锌染法（负染）：电泳胶用蒸馏水洗30秒，加入含0.1% SDS 的0.2 M 咪唑溶液摇动染色 10-15 min，再用去离子水洗数秒，加入0.2 M ZnSO4溶液摇动直至在暗背景下蛋白出现透明条带（约1min），移去ZnSO4溶液加入去离子水中止显色；胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。胶染（blue silver）法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝G-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，倒入数次去离子水摇动至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。考马斯亮蓝R250法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝R-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，用蒸馏水洗数分钟，倒入脱色液摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。 考马斯亮蓝快速染色脱色方法： a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现 胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 回收染色液。d. 加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。 h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。3-2 蛋白转膜杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC） 和PVDF 膜。膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45μm 和 0.2μm 两种规格的膜。大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜，小于20kD 的蛋白就要用 0.2μm 的膜了，如用 0.45μm 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。最常用于 Western Blot 的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和 NC 膜的特点相似，主要用于核酸杂交。硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC膜韧性较差，易损坏。聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。膜的选择主要根据：1. 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；2. 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；3. 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD 的蛋白。湿式转膜三明治排列为：海绵/滤纸/ 胶/ 膜/滤纸/ 海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确，负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。SDS-PAGE电泳完毕，用刀片或薄板将凝胶板的两块玻璃轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交界处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。然后将胶小心移入转膜缓冲液中。剪下与分离胶同样大小的0.45um的PVDF膜，以甲醇浸泡5s。剪下6张同样大小的滤纸，与PVDF膜，胶同时以转移缓冲液平衡15min。在转膜装置上从负极（黑底）到正极放置海绵垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵垫片（由下而上），放置时一定要排除气泡，特别是膜与滤纸、胶与膜、滤纸与胶之间。设置转膜电流为恒流，200mA，时间约需40min（蛋白大小不同所需时间不同，一般1KD约为1min）。转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的膜面。标准的电转缓冲液为 1X Tris-glycine buffer 不含 SDS，但加入 20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入 SDS 使之终浓度为 0.1%。PVDF 膜需要浸泡甲醇中 1-2 min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 min，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 min，否则转膜时会导致条带变形。电转移缓冲液中 SDS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：a) 大蛋白（大于 100 KD ）1) 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶， 8% 或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，2) 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此，转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1%的 SDS，以避免出现这种情况，甲醇易使SDS 从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。3) 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。4) 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF 需用甲醇活化。5) 选择湿式， 4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。b) 小蛋白（小于 20 KD）1) SDS 妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS 。2) 保持 20% 的甲醇浓度。注意事项：1. 避免直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑2. 排列三明治时，尽量用移液器或 15 ml 试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！3. 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效4. 鸡抗体易于与 PVDF 膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。3-3 膜上蛋白的检测：丽春红染色为检测转膜是否成功，无预染蛋白Marker时可用丽春红染色。染色方法：将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 min，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭。3-4 膜的封闭杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。Tween-20 的作用：Tween-20 是一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做 westen blot 时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如 SDS 则破坏蛋白的结构。传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或 BSA。脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。一般封闭条件为：5% 脱脂奶粉或 BSA 溶液室温或者 37℃缓慢摇荡 1-2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。封闭完成后进行洗膜，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min洗1次。3-5一抗的孵育孵育 Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用封闭液稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:1000-1:2000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育2 h。孵育时间：一抗的孵育时间可从2h至过夜（一般不超过 18 h）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在 4℃进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。孵育完成后吸取一抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3次。3-6二抗孵育用封闭液稀释二抗至抗体说明书规定浓度，将转有蛋白的PVDF膜浸入装有抗体的方形保鲜盒中，震荡孵育1-2 h。孵育完成后吸取二抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3-5次。3-7化学发光酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色，前者灵敏度很高，已经达到皮克级别，甚至还有飞克级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大 1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。发光液（A液、B液）1：1配置（注意避光），用移液器吸取合适量的发光液至覆盖PVDF膜，ECL发光仪上曝光并采集图像。四、常见问题分析与解决方案五、试剂及缓冲液配方1. 试剂:国药AR：丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(AP)、Tris、SDS、甲醇、乙醇、甘氨酸(Gly)、冰乙酸、磷酸、硫酸铵（常温保存）。2. 其它试剂：BSA、甘油、β-巯基乙醇、溴酚兰、Tween20、TEMED、丽春红、考马斯亮蓝G250/R250（常温保存）；ECL发光液（4℃保存）；二抗、蛋白分子量marker、PMSF（-20℃保存）。3. 耗材：PVDF膜（millipore）、滤纸、枪头。4. 缓冲液：30% Acr/Bis（棕色瓶）、10% 过硫酸铵、1×转膜缓冲液、5%BSA或脱脂奶粉封闭液（4℃保存）；1.5M Tris-HCl（pH8.8）、1M Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS 、5× SDS凝胶还原型加样缓冲液、10× TBS、10×Tris-Gly电泳缓冲液、10×转膜缓冲液、1× Tris-Gly电泳缓冲液、TBST（常温保存）。5. 缓冲液配制：a) 30% Acr/Bis：丙稀酰胺29.2g，甲叉双丙稀酰胺0.8g，双蒸蒸馏水溶解定容至100ml，过滤备用，4°C棕色瓶保存。b) 1.5M Tris-HCl（pH8.8）：Tirs 18.2g，溶于蒸馏水中，定容至100mL。加入盐酸调节pH值至8.8，常温保存。c) 1M Tris-HCl（pH6.8）：Tirs 12.1g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。加入盐酸调节pH值至6.8，常温保存。d) 10% SDS：SDS 20.0g溶于蒸馏水中，定容至200ml，加热至68°C助溶。常温保存。e) 10% 过硫酸铵(AP)：过硫酸铵0.1g，溶于1ml 蒸馏水中，现配现用或分装冷冻备用。4°C保存时最多不超过2w。f) 5×SDS凝胶还原型加样缓冲液：0.25 M Tris-HCl (pH 6.8) 1ml、SDS 0.25g、甘油 0.189g、溴酚兰 25mg，双蒸水定容到5ml，使用前加入β-巯基乙醇0.5ml。g) 10× Tris-Gly电泳缓冲液：Tris 30.2g，甘氨酸188g，SDS 10g，加入双蒸水定容至1L。1× Tris-Gly电泳缓冲液：用100ml量筒取100ml 10× Tris-Gly电泳缓冲液，加入到1000ml容量瓶中，用蒸馏水定容到1000ml。h) 10×转膜缓冲液： Tris 30.3g 、甘氨酸151.1g 、定容至800ml。1×转膜缓冲液：10×转膜缓冲液80ml、甲醇200ml, 加蒸馏水720 ml。i) 10× TBS：Tris 24.2g、氯化钠80g，双蒸水定容至1L，调PH 7.6。j) TBST：用100ml量筒取100ml 10× TBS，加入到1L容量瓶中，用蒸馏水定容到1L，再加入1ml Tween 20混合均匀。k) 封闭液：2g BSA或脱脂奶粉，溶于装有40ml TBST的50ml离心管中，配成5% BSA或脱脂奶粉封闭液，现配现用，短期4°C保存，较长时间则冷冻保存。l) 100mM PMSF：称量0.174g PMSF(针状结晶固体)溶于10ml 无水乙醇，震荡混匀，保存在-20°C。m) 2%的丽春红贮备液： 丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水定容至100ml，过滤，常温保存。丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O。n）考马斯亮蓝R250染色液：0.25%考马斯亮蓝R250，40%双蒸水， 10% 冰乙酸，50%甲醇混匀，过滤，常温棕色瓶保存。o）考马斯亮蓝R250染色脱色液：常温保存： 67.5%双蒸水，7.5%冰乙酸， 25%甲醇混匀，常温保存。p）考马斯亮蓝G-250染液： 10%磷酸，10%硫酸铵，0.12%考马斯亮蓝G-250， 20%甲醇，常温棕色瓶保存。配制方法：按就次序依次加入10%磷酸，10%硫酸铵，等完全溶解后加入0.12%考马斯亮蓝G-250，等完全溶解后加入20%甲醇混匀，过滤。 分离胶配方 5%浓缩胶配方文章来自：无锡菩禾生物医药技术有限公司编辑于 2020-08-13 15:26蛋白表达细胞生物学分子生物学​赞同 771​​8 条评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​文章被以下专栏收录细

Western Blotting实验详细流程（一） - 知乎

Western Blotting实验详细流程（一） - 知乎首发于基因表达切换模式写文章登录/注册Western Blotting实验详细流程（一）99.9度沸腾了原理：基本原理其实很简单的，本质是抗原抗体的特异性反应；SDS-凝胶在电场作用下将蛋白按大小分开（处理使分离仅仅与蛋白分子大小相关），然后转移到固相载体上，比如常用的PVDF（一种特殊吸附蛋白材料-不改变蛋白或多肽生物活性），封闭PVDF膜上未结合的位点（降低非特异性结果的出现），经过孵育一抗（抗目的蛋白的anti-body）、二抗（酶标记-常用HRP），与HRP底物反应在显影仪检测下间接检测目的蛋白。大概就是这么一个过程，具体操作就是下面啦！个人觉得孵育抗体是一个关键环节，与结果有很大的关系，一定要注意抗体的配制和孵育条件呢！图解：基本原理其实很简单的，本质是抗原抗体的特异性反应；SDS-凝胶在电场作用下将蛋白按大小分开（处理使分离仅仅与蛋白分子大小相关），然后转移到固相载体上，比如常用的PVDF（一种特殊吸附蛋白材料-不改变蛋白或多肽生物活性），封闭PVDF膜上未结合的位点（降低非特异性结果的出现），经过孵育一抗（抗目的蛋白的anti-body）、二抗（酶标记-常用HRP），与HRP底物反应在显影仪检测下间接检测目的蛋白。大概就是这么一个过程，具体操作就是下面啦！个人觉得孵育抗体是一个关键环节，与结果有很大的关系，一定要注意抗体的配制和孵育条件呢！图解：一、组织、细胞总蛋白抽提：参考相关裂解液；二、蛋白浓度测定：BCA法，这个结果要参考说明书！ 准备：BCA试剂，BSA，PBS/生理盐水，96孔板，100ul、20ul、10ul移液*及*头，1.5ml及4ml EP管，冰河1、配制BSA蛋白标准：配0.5mg/ml BSA，将25mg/ml的母液用RIPA 稀释成0.5mg/ml（RIPA可以换成PBS，下面的也是）；2、将BCA试剂A与B按50:1（2450 A+49ul B）充分混匀，配置成适量BCA工作液(4℃)；3、稀释BSA蛋白标准品和待测蛋白样品：用PBS稀释至20ul，再向每孔加入200ul BCA（ 在20-1000μg/ml浓度范 围内有较好的线性关系）注：按RIPA-BSA-样本-BCA的顺序加入，操作要迅速！4、锡纸遮盖，37℃恒温箱（或酶标仪）放置30min；5、置于酶标仪上测定A562（或A570），用excel建立标准曲线然后计算出蛋白浓度；注意：数据分析可以在Excel里做也可以在GraphPad Prism软件里做，R平方值越接近1数据越好三、Western blot步骤：（一）、玻板的清洗：自来水→75%酒精擦拭→ddH2O→竖放晾干/吹干（做胶的一面朝内）【勿用手指触摸玻板内侧面】装板：低的一面向内，确认玻板底部平齐，插入斜楔板压实卡紧，加ddH2O不漏，滤纸吸干水；（二）、配胶（1.0mm）： 分离胶5% 浓缩胶， 3 ml/块胶：注意：①、用*吸取胶，沿玻璃板一侧注入，先快后慢，*头不要打到底以防产生气泡，胶面升到绿色板上缘，用75%酒精封闭液面；②、室温放置约30min使胶充分凝固，待水和胶面之间有肉眼可见的折线，小心倒掉上层水，并用滤纸小心吸干水，勿碰触到胶面；③、TEMED作用为促凝胶，如其他试剂放置时间较长或气温较低不易凝胶时，可适量多加1~2倍 TEMED，或者多加点AP，胶就会很快凝固的；④、颠倒混匀后灌胶（约2ml），插入梳子，室温放置约30 min后，将玻板取出装入电泳装置，竖直向上将梳子拔出，放入电泳槽润湿板子，再拿出将玻璃板卡准；补充下浓缩胶的作用：（三）、点样及电泳：1、用10 ul *吸取电泳液，倾斜45°反复吹打上样孔，去掉胶的残渣；2、按顺序加样本，侧边孔加5ul marker，多余孔加入2ul loading buffer，迅速上样避免弥散；上样的量可以根据所测蛋白浓度来调整，有的建议20-40ug，有的50-100ug，其实个人觉得40-80ug比较适合的，主要看你样品浓度吧！3、恒压80V 约20min；待样品进入二胶的分界线时（时间也不一定20min，跑到交界处就可以改变电压），120V 约90min（设I=200，T=2:00）(100mA的条件也跑过-六一产的）；4、溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳；（四）、转膜：准备（提前30min）：1×转膜液、培养皿、甲醇、PVDF膜、剪刀镊子、尺子、切胶板、托盘、转膜夹、冰袋及冰。1、戴干净PE手套剪取PVDF膜（剪角做好记号以区分蛋白面），放入甲醇中浸泡约5min，用ddH2O平衡，再放入转膜液中15min；2、轻轻撬开玻璃板，按Marker指示切下目的蛋白所在区域的凝胶，浸入转膜液中；3、“三明治”：白板（+）→黑网→滤纸→PVDF膜→胶→滤纸→黑板（-）（记住蛋白带负电-向正极移动就行！）；4、将夹子放入转膜槽中，冰浴恒流180mA 70min（其实200mA，90min比较好的）；（五）、封闭：提前配制封闭液（一直用的4% TBST配制的脱脂奶粉），将膜放入孵育盒中，于脱色摇床上60 rpm室温摇2h；（六）、一抗孵育:1、弃去封闭液，TBST洗1次×5min；2、加入用TBST或5%BSA稀释的一抗（2%的TBST配制的脱脂奶粉，注意温度！特别是夏天，奶粉容易坏！），脱色摇床60 rpm 4℃ 过夜（或2-3h）；3、回收一抗，TBST洗膜3次×10min，摇床80~100rpm；(七）、二抗孵育：加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育60min；TBST 洗5次×5min或3次×10min；注意：洗膜时间可以稍微长一点，一抗和二抗的比例需要参考说明书，保存和回收条件也是，一抗是什么动物来源的，二抗就是抗一抗动物的抗体，比如说，一抗是来源于Rabbit，二抗就是Anti-Rabbit（八）、ECL显色：准备：显影液、玻璃片、保鲜、镊子、EP管、*及*头、滤纸。在暗室中将ECL试剂以1：1混合（约100ul），用滤纸将PDVF膜稍干燥后置于玻板上，滴加适量显影液在蛋白面上， 显影；选【印迹】-【Chemi】进行成像，actin设置10-30s、10张，目的蛋白设置20s-100s，20张，可延长至500-1000s；【其他】-【protein mark】进行marker成像；注意：曝光的时间与蛋白大小有关系，一般小蛋白曝光时间短些，做多了就能找到合适曝光条件！结果:发布于 2020-03-20 13:11免疫蛋白质组学基因表达​赞同 171​​12 条评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​文章被以下专栏收录基因表达You are gene,I am prot

为什么Western Bloting实验中要进行封闭? - 知乎

为什么Western Bloting实验中要进行封闭? - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答​切换模式登录/注册wb实验Western印迹法为什么Western Bloting实验中要进行封闭?关注者2被浏览13,254关注问题​写回答​邀请回答​好问题​添加评论​分享​2 个回答默认排序维真生物​已认证账号​ 关注wb实验中封闭的目的是利用一些无关蛋白将膜的残余结合力饱和掉，避免一抗和膜发生非特异性结合。不同的一抗可能配合特定的封闭液使用方能产生最佳效果。必要时可多评估几种封闭液的效果。注意封闭液不能含有与一抗或二抗发生特异性反应的成分。常用封闭液包括：1. 0.5%的脱脂牛奶（溶解于0.1%Tween的PBS）最常用。脱脂奶粉的品牌没有限制。2. 明胶（gelatin）。一般鱼皮明胶效果最好，通常2%的浓度。3. 牛血清白蛋白（BSA）。通常用WB或免疫反应级的BSA，浓度2%，比鱼皮明胶便宜。4. 胎牛（马）血清。常用10%的浓度，但价格昂贵。此外，血清中含有免疫球蛋白，可能和某些二抗不相容。5. 酪蛋白（Casein）。常用1%的浓度，但酪蛋白干粉难溶于水。当采用avidin或streptavidin作为检测试剂，而待检样品中又含有生物素蛋白（biotin）时，需使用更为特异的封闭液。因为avidin或streptavidin能直接捕获这些内源性biotin。同时做阴性对照，即不加一抗的情况下使用avidin或streptavidin进行检测。如果阴性对照中出现条带，即说明avidin或streptavidin结合到了内源性biotin。解决办法是，在孵育一抗前先用avidin孵育以封闭掉内源性biotin，再用biotin二次封闭，封闭掉之前加入的avidin所产生的所有残余结合位点。最后洗掉未结合的biotin，即可进行后续的抗体检测。发布于 2022-12-12 09:48​赞同 2​​添加评论​分享​收藏​喜欢收起​科研不好找星球上的笔记本，超级科研​ 关注在做Western blot实验中，会用到固相载体，在这些固相载体表面有很多孔隙（如筛子般孔洞），通过恒流湿转或半干转，凝胶上覆着的蛋白质被转移到膜上，蛋白以机械填补和吸附的方式结合于膜表面。蛋白印记到有很多微米级孔洞的NC膜，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的孔，这样就会有很多非特异性的信号。为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该是具有封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应的特性。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。Western blot转膜后的封闭液的选择应该根据实验的具体要求和条件来决定，不同的封闭液可能会对实验结果产生不同的影响。除了封闭液的选择，还有一些注意事项会影响Western blot转膜后的封闭效果。首先，封闭液的温度和时间应该根据实验的具体情况来决定。一般来说，低温封闭液可以减少非特异性抗体的形成，但同时也可能会影响特异性抗体的结合。因此，需要根据实验的目的和要求来选择适当的温度和时间。根据实验的目的和条件，可以选择不同的封闭缓冲液。例如，对于蛋白质表达较低的样品，可以选择含有高浓度封闭试剂的缓冲液，以提高非特异性结合的抑制效果；而对于蛋白质表达较高的样品，可以选择含有低浓度封闭试剂的缓冲液，以避免影响特异性条带的表达。其次，封闭液的pH值也会影响非特异性抗体的形成。一些封闭液的pH值可能不适合某些抗原的保护，因此需要根据实验的具体情况来选择适当的pH值。除了封闭试剂的选择，封闭步骤的时间和温度也是影响实验结果的重要因素。一般来说，封闭时间不宜过长，以避免非特异性信号的干扰；同时，温度也要适宜，以促进抗原抗体的有效结合。此外，封闭试剂的浓度和膜的清洗次数等因素也会对实验结果产生影响，需要进行适当的调整和优化。一般是将在膜封闭液中4℃下脱色摇床孵育1-2小时左右，封闭孵育后，在TBST缓冲液中冲洗膜3次（每次5min）。除了提到的脱脂牛奶、BSA、酪蛋白和封闭凝胶溶液，还有一些其他的封闭液也可以用于Western blot转膜后的封闭操作。例如，一些实验室会使用封闭血清，如山羊血清或兔子血清，作为封闭液，它们可以为膜上的抗原提供更好的保护。此外，一些实验室还会使用特定的封闭剂，如抗氧化剂或抑制剂，来减少非特异性抗体的形成。总之，封闭步骤是Western blot实验中不可或缺的重要环节，需要认真遵守实验操作规范，选择合适的封闭试剂和条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。封闭液的质量和纯度也是影响封闭效果的重要因素。如果封闭液的质量和纯度不高，可能会影响非特异性抗体的形成，从而影响实验结果的准确性。发布于 2024-01-25 19:05​赞同​​添加评论​分享​收藏​喜欢收起​​

蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)- Western Blot 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）-丁香实验

 原理与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显色」用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。材料与仪器

【试剂】

PBS、RIPA 裂解液、ddH2O、loading buffer、甲醇、抗体等；

【器材】

EP管、PVDF 膜、-20℃ 低温冰箱、匀浆器、高速离心机、电泳转移装置；

步骤一、蛋白样品准备：

1、以 6 孔板为例，先吸尽培养基，1xPBS 漂洗一下残留培养基（手动轻轻晃几下即可）后，加入预先配置好的含有终浓度 1mM PMSF/PI（检测磷酸化，可以加入 Na3VO4，NaF）的 RIPA 裂解液 500ul（RIPA 相对温和，适合 Co-IP；对于一般 WB 裂解，或对膜/核蛋白 WB，可以加入含有去垢剂 0.1% SDS 和脱氧胆酸钠的细胞裂解液，增加裂解效果）。

2、加好后用细胞刮（或枪头吹打）将细胞刮离孔底，吸回细胞裂解物至 EP 管中，4℃ 裂解 0.5-3 hour，可置于冰箱内旋转机器上使样品充分混匀裂解；

裂解完成后，12000rpm 4℃ 离心 10min，吸回上清，在吸回的上清中加入等体积的 2X loading（或 4X）并混匀，再将样品于 95℃ 变性 15min，变性结束后，样品可用于 SDS-PAGE 电泳。样品冻存于 -20℃ 或 -80℃。

3、制备组织样品时，按 0.1g 组织用 1ml 裂解液的比例在匀浆器中对组织进行研磨裂解，研磨充分后，将匀浆液吸至 EP 管中，至于冰箱内旋转机器上使样品充分混匀裂解 0.5-3 hour；

裂解完成后，12000rpm 4℃ 离心 10min，吸回上清，后续处理方法同细胞样品。

二、制胶及电泳：

    用于制胶的玻璃板注意使用前清洗干净并晾干；注意玻璃板与胶接触的一面是否有划痕，尤其是下边缘破损，划痕可能导致电泳过程中出现漏样。

1、胶的配方：

配置合适浓度的分离胶，在胶板下层注入分离胶后，向胶板内轻轻注入 ddH2O 或异丙醇起到液封的作用，促进分离胶凝固；约 20min 分离胶即可凝固，可以倾去用于液封的 ddH2O，并倾斜放置胶板一会，让残余的 ddH2O 汇聚到一起后方便用滤纸吸尽；将胶板放平后继续配置浓缩胶，将浓缩胶注入胶板中，至薄玻璃板的上缘即可，尽量不要产生气泡，然后轻轻插入梳子即可；胶约 20min 后即可凝固使用。

2、电泳缓冲液为 Tris-Glycine-0.1%SDS 缓冲液。小分子蛋白（<15kD），建议用 Tris-Tricine，可以让条带压得更细。

3、100V 电泳，并根据实验需求及时终止电泳。一般浓缩胶电流小于分离胶电流。

提前配置转膜缓冲液并预冷备用（赶跑气泡）。转膜缓冲液为含有20%（v/v）甲醇（或等体积乙醇）的Tris-glycine溶液。

三、转膜：

1、先从胶板中将胶取出，根据具体实验需要确定是否取出浓缩胶部分，将胶在转膜缓冲液中浸泡 10min；裁剪与胶大小一致的 PVDF 膜和滤纸（统一：PVDF 膜 5.5X8.5 cm，滤纸 7X9 cm），PVDF 膜先用甲醇浸润 1min，再转入转膜缓冲液中浸泡 10min；

2、转膜时，转膜用的夹子黑色面在下，然后依次放：转膜用海绵垫，湿润的三层薄滤纸，蛋白胶，PVDF 膜，湿润的三层薄滤纸，转膜用的海绵垫；在放 PVDF 膜之前，先在蛋白胶上加少量的转膜缓冲液，放膜时将膜的一侧边缘与胶对齐后，膜会被溶液慢慢吸到胶上去，这样可以避免产生气泡；然后将夹子夹紧后放置到转膜槽内，注意夹子的黑色面要靠近转膜槽的黑色面，转膜槽电源接头处的颜色要与外面塑料槽标记的颜色匹配，防止正负电极搞错。

如果使用 NC 膜，则略去用甲醇浸泡的步骤，其余步骤不变。

3、转膜条件：100V，2h，冰浴（大分子蛋白可以增加到 3h）。

4、转膜完成后，可使用丽春红对膜进行染色，确定转膜是否成功。

四、封闭及抗体孵育：

1、封闭使用含有 5% 脱脂奶粉的 1xTBS（pH7.4），室温 1h，于摇床上进行；一抗孵育在 4℃ 冰箱的摇床上进行，孵育过夜，抗体稀释于含有 2% 脱脂奶粉的 0.1% Tween/TBS（pH7.4）中（为防止回收抗体变质，孵育前需添加 0.02% 的 NaN3）。孵育结束后，回收一抗储存于 4℃；用 1xTBST (0.1%Tween/TBS) 洗膜，10min/次，共洗 3 次。

2、二抗稀释（1:5000）于含有 2%  脱脂奶粉的(0.1%Tween/TBS)（pH7.4）中（HRP二抗不能添加 NaN3），于摇床上室温孵育 1h；孵育完成后，用 1xTBST 洗膜，10min/次，共洗 3 次。

五、显色及压片：

1、在干净的塑料膜上加适量的显色底物，然后将膜正面对着底物，让膜贴上去，室温静置 1-2min 后可到暗室压片；压片时需要根据荧光强弱选择适当的曝光时间。初学者起始 1min，然后根据黑暗中是否看到荧光，直接压 >5min 或快速几秒。以曝光时间 30s 为例，将膜正面（右上角折角作为记号）向上至于压片盒中，将 x 光片放到膜上，关紧压片盒，计时 30s，然后打开压片盒取出 x 光片，先在显影液中浸润 1min 后再在 ddH2O 中漂洗 10s，最后在定影液中浸润 1min 即可。可根据 X 光片上的条带强弱情况，具体再选择合适的曝光时间。为了充分利用胶片，建议把膜不要放正中间，这样可以一张胶片压多个时间点。

2、对荧光强度特别强的膜，可以把膜翻过来，从膜背面压片。或快速用手按紧胶片即刻拿走冲片。或同时压两张胶片。或等待一段时间再压片。新手不建议一次检测多张膜。

原则: 强信号和弱信号兼顾。

3、对荧光强度特别弱的膜，可以使用超级灵敏底物，动作紧凑，不要浪费信号。

4、压片完成后，及时标记 marker，做好记录，并且保持 PVDF 湿润，可以在 TBS 中 4℃ 暂时保存。

六、Reprobe：

压片完成后，需要对膜重新进行别的抗体的检测时，先用 1xTBST 洗膜 10min，在合适的容器内用 strip buffer 处理 20min，最后用 1xTBS 再洗 10min，膜即可进行重新的封闭及抗体孵育。

 注意事项常用 buffer 配制：

1）Cell Lysis Buffer:

150 mMNaCl

10 mM EDTA

1% Triton X-100

0.1% SDS

1% Na-deoxycholate

PIC/0.25 mM PMSF

in 50 mMTris-HCl pH 8.0

检测磷酸化：可以添加 Na3VO4: 1 mM ; NaF: 1 mM 或磷酸酶抑制剂 Cocktail

2）SDS-PAGE stock solution

(1) Monomer Solution (30%T 2.7%CBis)(4℃)

    Acrylamide     58.4 g

Bis             1.6 g

d2H2O         to 200 ml

(2) Separating Gel Buffer (1.5M Tris-HCl pH 8.8)

Tris 36.3 g

d2H2O    to 200 ml

(3) Stacking Gel Buffer (0.5M Tris-HCl pH 6.8)

Tris       3 g

d2H2O    to 50 ml

(4)Samle Buffer

Tris-HCl pH6.8 (Solution(3))  0.25ml

SDS(Solution(4))                     0.4 ml

Glycerol                            0.2 ml

2-mercaptoethanol                    0.1 ml  

40mg/ml BPB                       0.05ml

                 -------------------------------

total:                              1 ml

(5) 10x Running buffer pH 8.3

Tris                 30 g

Glycine             144 g

SDS                10 g

d2H2O         to    1000 ml

（6）Transfer Buffer (25mM Tris, 192mM Glycine, pH 8.3 ):

Tris            3.03 g

Gly            14.4 g

甲醇或乙醇     200 ml

add d2H2O to    1000ml

（7）Ponceau S solution  (0.5% Ponceau S dissolved in 2.5% HOAc) .

e.g. 50ml :   0.25g Ponceau S / 1.25 ml HOAc / 48.75 ml d2H2O)

（8）温和型 Strip buffer (100 ml):

1.5g Glycine/0.1g SDS/1ml Tween-20 in 100 ml H2O, PH2.2,常温反应

       剧烈型 strip buffer(100ml):   

687ul 2-ME/20ml 10%SDS/12.5ml Buffer3 (stacking buffer)，50C 反应常见问题Western blot 实验常见的问题：

（1）参考书推荐

A. 对初学者看什么资料比较好？

解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow，david lane）两本书不错。

（2）针对样品的常见问题

A. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120 μg，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？

解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

B. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？

解答：一般地 5 × 106 就足够了。

C. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响?

解答：能，没有问题，我们做过。

D. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？

解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

E. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。

F. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加 5~10％ 甲醇。

G. 想分离的蛋白是分子量 260 kDa 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作 Western Blot 吗？

解答：260 kDa 的蛋白不好做，分离胶用 6％，Stacking Gel 3.5％。

H. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载 30％ 是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5 mm 的 comb。

I. 蛋白变性后可以存放多久？

解答：-80 ℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉 (也是被酶水解了)。

J. 我所测定的蛋白分子量是 105 kDa，按理说分离胶应当采用 7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用 11％ 的配方，不知为何？

解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为 105 kDa 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

K. 接下来我准备采用 DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用 5％ 的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用 BSA 代替应该好一点。

L. 一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

解答：Western Blot 一般上样 30~100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳 性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

M. 做组织样品的 western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比 BSA 好一点？

解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入 ＰＭＳＦ 和蛋白酶抑制剂 cocktail），封闭剂一般 5% 脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用 BSA 也是不错的选择。

N. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白 200 kDa，在做 western 要注意什么呢？

解答：做 200 kDa 蛋白的 Western Blot 时要注意，分离胶最好选择 7% 的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

O. 有什么方法可以提高上样量？

解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。

P. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为 42 kDa 的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42 kDa 的蛋白分子量算不算大？

解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用 RIPAbuffer 提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做 Western Blot 就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42 kDa 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

Q. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了， 但是不要超过 0.3 μg/mm2。

R. 一抗，二抗的比例是否重要？

解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

S. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗。

T. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的 ELL+plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短 Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般 37 ℃，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1:1 500；二抗 1:20 000 试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是 5 × 5 min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！

U. 免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗？

解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）

V. Western Blot 中抗体的重复应用问题

解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 2~3 次。稀释后应在 2~3 天内使用，4 ℃ 保存，避免反复冻融。来源：丁香实验预览相关方法底物化学发光 ECL 法2023-07-14wb实验中，小分子蛋白跑不出来的原因及对策？2023-06-08western blot 问题条带的原因？附解决办法2023-06-05相关问答问做WB用预置胶跑maker条带很挤3 回答 501 围观2022-04-06问小分子蛋白（10KD）WB实验电泳液中不加SDS，但是wb不就是依靠SDS聚丙烯凝胶电泳的吗？如果不加SDS，是用tris填平吗5 回答 347 围观2024-02-06问请问有没有会取小鼠背根神经节的大佬！求指导，求发视频啊2024-03-09推荐阅读Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western Blot详解－原理提问48 小时有问必答扫一扫实验小助手关注公众号反馈TOP打开

【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应 - 知乎

【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应 - 知乎首发于生命科学科研技术切换模式写文章登录/注册【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应Doctor Zero​西安交通大学 临床医学博士在《谁发明了Western-Blotting？》中我们提到，Western-Blotting（WB）起源于核酸印迹——Southern Blotting和Northern Blotting，二者的基本原理是通过琼脂凝胶，将分子量不同的DNA和RNA分离，然后转膜及用特异性探针检测。与其类似，目前被广泛应用的WB方法也是用SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白分离，然后用特异性抗体（一抗和二抗）检测特定的蛋白。之所以能用WB检测目的蛋白，其核心理论就是特异性抗体与目的蛋白之间的抗原抗体特异性反应。本质上讲，WB所用的特异性一抗二抗和我们要检测的目的蛋白都属于蛋白质。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。在机体内，当免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟为浆细胞后所合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白（immunoglobulin，Ig），激活补体系统从而解除抗原对机体的损伤。Ig是由两条相同的轻链（L链）和两条相同的重链（H链）通过链间二硫键连接而成的四肽链“Y”字型结构。每条L链由可变区（variable region）和恒定区（constant region）组成；每条H链也有可变区和恒定区组成，其中恒定区可分为三个结构域。从N-端起，H链的1/4肽段及L链的1/2太短在各类Ig的排列顺序可变性大，称为可变区（V区），其功能是决定不同Ig与抗原结合的特异性。Ig可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五类，IgG分子结构图见下。由于抗原、抗体在结构上具有相互识别相互嵌合的构象，抗原分子表面具有抗原决定簇（抗原表位）可与抗体分子的超变区中沟槽分子表面的抗原结合点之间在化学结构和空间结构上是互补关系，所以抗原抗体结合反应是特异性的（见图）。本段内容、IgG分子结构图及抗原-抗体的特异性反应图摘自《生物化学与分子生物学 第9版_周春燕、药立波主编2018年》。影响抗原-抗体特异性结合的影响因素包括：1、酸碱度：抗原抗体特异性结合的最适酸碱度pH 6.0-8.0；2、电解质：电解质可以影响溶液pH，也可影响蛋白质的等电点；（因此，WB的洗膜缓冲液，均用PBS/PBST或TBS/TBST等平衡盐液体，抗体稀释液和封闭液也多是上述液体配置，是为了保证抗原抗体反应的最佳条件）3、温度：一般为15-40℃，最适为37℃；（常用的一抗孵育时间为：室温，2-3h；二抗孵育时间：室温，1h。此外，4℃过夜封闭也应用广泛，这与抗原抗体反应的反应特点有关，涉及抗原抗体的结合率）抗原抗体反应的主要特点有：1、特异性：特定的抗体只能与特定的抗原（肽段/蛋白）结合，这在WB一抗二抗的种属及反应性的选择常用到；2、比例性：抗原抗体在整个反应中存在一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应；WB中蛋白上样量和一抗二抗的稀释比例与此有关，实际操作中抗体的量相对较多，这也是为何抗体可以反复使用的原因之一；3、可逆性：抗原抗体的结合是非共价结合，在一定条件下这种非共价结合是可逆的；因此，同一NC膜/PVDF膜在Stripping（抗体洗脱）以后可以用来检测其他蛋白；4、阶段性：抗原抗体特异性反应分两阶段，第一阶段反应迅速，第二阶段反应缓慢，两阶段均为特异性结合；WB中抗原抗体结合在室温下，反应1小时结合率可达95%，2小时可达97%以上；4℃在，反应4-6小时可达90%，8小时可达95%（本人忘记了具体的数值，但大致如此）。发布于 2020-03-20 16:03分子生物学抗体免疫​赞同 54​​7 条评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​文章被以下专栏收录生命科学科研技术分享生命科学科研技术的实验方法和个

western blot 的原理是什么？ - 知乎

western blot 的原理是什么？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答​切换模式登录/注册实验分子生物学医学生物实验生物western blot 的原理是什么？关注者257被浏览534,143关注问题​写回答​邀请回答​好问题 14​添加评论​分享​31 个回答默认排序酸菜​科研等 2 个话题下的优秀答主​ 关注Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。电泳分离后的蛋白转移到固相载体PVDF膜上，以共价键的形式吸附蛋白质，并作为抗原结合特异性抗体。二抗作为显色标记，经过底物显色反应组织和细胞中蛋白的表达情况。蛋白提取1. 组织蛋白提取相对于细胞而言，组织蛋白的提取对技术和外界环境要求会更高一些。因为我们养的细胞很多是根据具体实验选择的特定细胞，而组织大多是为了丰富体内实验的各种蛋白的混合体，目的蛋白的含量并不一定充分，而且其中还包含着丰富的蛋白酶、血液或者脂肪等干扰因素。所以个人认为，提取组织蛋白一定要做预实验，这是很有必要的。可以摸清楚每次应该取多少重量的组织，什么样的离心条件可以去除血液和脂肪的干扰。比如像心脏、脾这类血液较多的组织，剪成米粒大小的小块儿后，加入适量PBS(PBS:PMSF=100:1，PMSF为苯甲基磺酰氟，蛋白酶抑制剂，30min内会降解一半，因此每次提取蛋白要加新鲜的PMSF)，7500g离心力，离心5分钟，去上清。如果感觉血液还是很多，可以重复上述步骤数次。蛋白提取的全程要在低温环境下进行，以防止蛋白降解。30mg的组织对应500ul的RIPA裂解液（RIPA全称为Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA:PMSF=100:1），置于冰上，使用研磨棒或电动组织研磨器充分研磨30分钟，再置于冰上静止30分钟。在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。2.细胞蛋白提取细胞蛋白的提取相对来说耗时会少很多，只是在贴壁细胞和悬浮细胞的处理方式上略有不同。对于贴壁细胞而言，去除培养基后，用无菌预冷的PBS清洗3次，每次3分钟。对于像6cm的培养皿，我习惯每次加100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），转动培养皿，让裂解液接触到整个皿面。之后用细胞刮刀将皿里的细胞刮刀一侧，冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。对于悬浮细胞而言，吸出培养皿中的培养基，按照传代时离心力大小和时间进行离心。离心结束后，小心的倒掉上清，加入100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。3.测定蛋白浓度蛋白浓度的测定一般选用BCA工作液（bicinchoninic acid），BCA工作液作为一种稳定的水溶性复合物，可以与二价铜离子结合，产生紫色复合物。562nm波长条件下测定吸光度，制作标准曲线，吸光度与蛋白浓度成正比。4.蛋白变性根据蛋白的体积，计算加入多少体积的1*loading buffer，煮沸5分钟即可。Loading buffer中主要含有溴酚蓝、二甲苯氰和甘油。前两者起到指示作用，甘油起到沉降蛋白的作用，以防加样时蛋白飘出。电泳1.制胶根据目的蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶，8%、12%和15%三种浓度的分离胶就完全可以搞定日常蛋白的测定。一般测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。有的时候蛋白跑不出来，其实未必是分离胶浓度选的不好，也有可能是marker的问题。marker起到的是蛋白分子量指示剂作用，但是要根据蛋白分子量选择合适的marker。一般的marker分子量范围在10-130kDa之间，都可以满足正常蛋白的需要。但有些分子量范围较广的marker，比如说6-250kDa，虽然说它范围很广，可中间的蛋白分子量并没有区分的很细，只适用于大分子或小分子蛋白，而对于30-70 kDa的蛋白并不是很适用。2. 电泳条件个人使用的条件一直是80V，300mA跑浓缩胶，120V，300mA跑分离胶，恒压电泳。当然了，这个电泳条件不是固定的，也有人选择恒流跑电泳。个人认为恒流和恒压对电泳的效果影响没有什么区别。因为配胶的成分中SDS起到的作用是破坏蛋白质分子和其它物质分子之间的非共价键。解聚后的蛋白质分子与SDS形成的复合物带有负电荷，远远超过蛋白质本身的电荷量，所以就不存在不同蛋白质分子之间的电荷量不同造成的影响了，恒压或恒流都只是起到推动作用。至于浓缩胶和分离胶的条件不同，我想这一点大家应该都很清楚了。浓缩胶中的孔隙较大，起到的作用是为了让蛋白质混合物在进入分离胶之前都到达同一起跑线，以便在分离胶中更好的分开，因此一定要充分跑完浓缩胶之后再调电压。转膜转膜分为湿转和干转。湿转就是把三明治结构放在转膜液中进行；干转，其实应该是半干转，虽然不放在转膜液中进行，但是滤纸也要事先泡过转膜液。有人说，湿转主要用大分子蛋白质转膜，半干转主要用于小分子蛋白质转膜，但是个人认为湿转就完全可以搞定大小所有分子量的蛋白，而且从转膜稳定率来说要好于半干转。所以个人习惯于用湿转。一般情况下的转膜条件是220V，300mA，转膜时间是1小时20分钟。对于10-180kDa分子量的蛋白，这个条件是完全可以的。虽然网上有很多人说小分子量的蛋白需要缩短转膜时间，或者改变电压电流，但是本人试过用这个条件转8kDa的蛋白质，一样没有问题。相反的，我缩短了转膜时间，或者改成了100V，300mA的转膜条件，转膜的效果反而不好。所以个人认为，转膜效果的好坏除了要考虑机器本身设定的条件外，还需要考虑一下其他因素。有很多新手用完转膜液忘记放回4度冰箱，时间久了，转膜液的离子成分就会发生改变，影响转膜效果；或者是滤纸使用太久了，也会影响转膜效果；又或者是要研究的蛋白自身性质决定的。Western blot并不适用于所有的蛋白，对于检测一些分泌型的蛋白，ELISA会更适合，所以也并不是说蛋白实验一定要用Western blot。发光选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液，按照1:1的条件混合配制。洗膜结束后，倒出多余的TBST，但是也要在洗膜的塑料盘中留有一些，防止PVDF膜干掉。基本上1ml的工作液可以覆盖10cm3，发光的效果与发光液的新鲜程度有关，所以要现用现配。ECL的发光原理是：发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化，产生荧光，整个发光过程被增强剂增强了发光效果，可以将灵敏度提高到1000-100000倍，但是也会遇到猝灭的情况，除了成像机器老化的原因外，也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。质量好的发光液配合着合适的一抗二抗浓度，才能快速完美的发光。小于1分钟的发光时间固然是我们所向往的，但是碰上信号低的蛋白，我们也要想尽办法让它们显示出结果。对于信号弱的蛋白条带，我们可以手动调整发光时间少一些，比如说10sec，快速曝光比延长曝光时间的显影效果更好。用各种软件处理分析蛋白条带1.Photoshop CS6PS软件在后期投稿整理图片方面会有很大作用，这里我想说的是利用PS改变条带的对比度，减少后续利用Image j对蛋白灰度值进行测定时的干扰。正常机器发光之后的图片，背景都会泛蓝，我们可以选择PS软件中，图像-调整-去色，把条带背景统一调成灰色后再测灰度值。2.ImageJ利用Image j测量蛋白灰度值的方法，我想大家都很熟悉了，我就不详细的列出每一步了。这里想提到一点，BCA测出的蛋白浓度有时会存在一定的误差。我们在测蛋白标准曲线时，得出的R值肯定是9越多越准确，但是实验过程中，我们往往只有一或两个9，导致内参发出来的效果也是各组略有差异。为了追求完美，我们可以通过内参的灰度值进行作比，以一个组的蛋白浓度为定量，适当调整其他各组上样量即可。知乎专属福利；助大家一臂之力、我为大家准备了一份基础实验protocol,细胞侵袭、细胞凋亡、细胞黏着、细胞周期等，不仅有细胞培养相关实验，还有包括不同研究水平实验技术Protocol，不同实验方法全流程，WB实验流程、注意事项、数据处理及写作、IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等相关实验的详细步骤，全都是经过前辈们无数次验证过的，希望对大家的实验有帮助。点击下方链接可扫码添加酸菜老师助手，知乎私信不回问题：中国临床医生科研成长平台；小助手会免费赠大家一门医学SCI从入门到精通学习营，添加即送！编辑于 2023-04-14 17:22​赞同 413​​18 条评论​分享​收藏​喜欢收起​科研根号三​实验室多年经验分享​ 关注刚好最近做完了实验，实验室要带师弟师妹做western blot实验了，western blot实验相关的经验总结写了几个晚上，这里一起分享给大家，刚入门的同学可以多看看~Western Blotting技术是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体（例如纤维素薄膜）上，利用抗原抗 体反应来检测目的蛋白的方法。如果整个实验过程中每一个实验步骤都能成功，就可以获得很好的实验结果。 除了对Western Blotting实验操作流程，对各步骤的操作方法和注意事项进行了通俗易懂的说明和介绍。 这里也会对实验操作中遇到的各种问题给出解决方法。Western blot实验教程大全，里面有实验的视频操作教程~额外分享：有需要的小伙伴可以自行下载~免费，亲测安装！56个科研人必装软件安装包 （11月更新）实验数据/图片处理+文献管理+科研绘图+写作翻译+统计分析+办公常用链接：https://pan.baidu.com/s/1JkjM67dHoKsY3K5AkLGrTg?pwd=6868 提取码：6868 一、Western Blotting检测的操作方法和注意事项觉得有用的话记得小手双击屏幕点个赞同❥(^_-)二、Western Blotting 实验问题及解决方案问题1：有污渍或斑点，整体背景普遍偏高问题2：出现白色条带问题3：出现非特异性条带问题4：信号弱或无信号Western BLoT Immuno Booster（制品code T7111A）可有效改善结果。 Western BLoT Rapid Detect v2.0（制品code T7122A） 可有效改善结果。 问题5：膜上部分无信号问题6：条带扩散三、Western Blot中结果条带的各种稀奇古怪结果图解析1. 啥也没有原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。2. 高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。3. 非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。4. 条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。5. 条带中间出现白色（反白）原因：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了解决办法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。经验：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。6. 出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗经验：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。7. 条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5min*5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。8. 出现重影原因：荧光强度比较高，在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离解决办法：X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系。经验：有的时候出现重新刚好在上下位置，并且重影会相对弱一些，不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。9. 出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干经验：在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。10. 某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。11. 条带呈哑铃状原因：配置胶有问题解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，不知道大家有没有出现如下的配胶情况，下图中示意拔完梳子之后的结果，如果你拔完梳子之后出现图中下面部分的样子，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。12. 最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽； 不使用两边的两孔经验：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。13. 其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。14. 电泳过程中出现现象及问题（1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。（2）整个条带呈“ ︵ ”： 凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。有时间再把一些经验分享给大家，今天就先到这里~点个赞同，祝你实验顺风顺水~推荐内容绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？ 有哪些好用的zotero插件?有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？有没有什么很好的科研作图软件？顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！ NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）2023年更新！EndNote X9永久激活版本（序列号激活），最稳定，可汉化！写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！western blot是为了什么？如何学习和记忆细胞信号通路？最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年编辑于 2023-12-19 15:33​赞同 110​​添加评论​分享​收藏​喜欢

蛋白质印迹（Western blot）实验方案| Abcam中文官网

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Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab205718)

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查找合适的 HRP 二抗

荧光 WB 指南

Western blot 培训

我们的 western blot 实验方案包含溶液、试剂、检测步骤和有用的链接，可指导您完成整个实验。2020 年 12 月 14 日审核Western blot 是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白，然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或 PVDF（聚偏二氟乙烯）制成的膜。将凝胶紧贴膜放置，蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理，再通过二抗和检测试剂让膜显色。目录溶液与试剂：裂解缓冲液溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液样本裂解样本制备上样和跑胶蛋白转膜抗体染色相关链接网络研讨会记录查看下方的 western blot 实验方案视频。

查看更多实验方案视频，请单击访问我们的方案视频库。>> 打印完整的 western blot 实验方案>> 查看我们的 western blot 实验方案图如需提升 western blot 分析技能，请查看我们的免费 western blot 培训（可点播）。

溶液与试剂：裂解缓冲液这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周，也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。NP-40 缓冲液150 mM 氯化钠1.0% NP-40（可用 0.1% Triton X-100 代替）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀检测缓冲液）150 mM 氯化钠1% IGEPAL CA-6300.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl20 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）蛋白酶抑制剂

溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液

Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 值并将 pH 值调整至 6.8电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）25mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3转膜缓冲液（湿转）25mM Tris base （三羟甲基氨基甲烷游离碱）190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。转膜缓冲液（半干转）48mM Tris base39mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液3–5% 牛奶或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积，这种小暗点会在显色时影响实验结果。

样本裂解细胞培养裂解液的制备将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 烧瓶加 1 mL；每 5x106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 烧瓶加 0.5 mL）。用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。4℃ 下持续振摇 30 分钟。放入微型离心机，在 4°C 下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间；指南给出的参考标准是在 12,000 rpm 转速下离心 20 分钟，但须根据您的实验确定（白细胞所需的离心力很小）。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。组织裂解液的制备3.1 用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约 5 mg 的组织，向管中迅速加入约 300 μL 裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X 裂解液冲洗刀片两次，每次 200 μL，然后在 4℃ 下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇 2 小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL。在微型离心机中 4℃ 下按照 12,000 rpm 的转速离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。样本制备取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。确定蛋白质的上样量，并添加等体积的 2X 稀释 Laemmli 样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100°C 下煮沸 5 分钟。裂解液可等量分装并在 -20°C 下储存备用。上样和跑胶3.1  将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30 μg，纯化蛋白的上样量为 10-100 ng。3.2  在 100 V 下跑胶 1-2 小时。时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。凝胶百分比取决于目标蛋白的大小：蛋白大小凝胶百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10-70 kDa12.5%15-100 kDa10%25-100 kDa8%也可以使用梯度凝胶。蛋白从凝胶转移到膜膜可以是硝酸纤维素，也可以是 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。转膜层的制备如下：

图 1.制备好的转膜层示例。

​抗体染色

用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时或在 4°C 下封闭过夜。用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在 4°C 下过夜孵育；其他条件可以优化。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜 1 小时。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。产生信号时，请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。

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查看更多 western blot 实验方案查看所有 Abcam 内参对照。示例内参对照：ab8227 beta actin

所有泳道：beta Actin 抗体 - 内参对照 (ab8227)，稀释度为 1/5000泳道 1：HeLa 全细胞提取物泳道 2：酵母细胞提取物泳道 3：小鼠脑组织裂解液查看我们可提供的阳性对照裂解液、封闭肽和阳性对照蛋白清单。查看蛋白质印迹中表现出色的 AbExcel 二抗。观看我们简单易懂的实验方案视频。实验方案由 Abcam 根据 Abcam 实验室使用 Abcam 试剂和产品开展的实验“按原样”提供；在其他条件下使用实验方案得出的结果可能会有所不同。网络研讨会记录Western blot 的目的在于按照分子量大小在凝胶上分离蛋白。然后将蛋白转移到膜上，从而使用抗体对蛋白进行检测。在含有还原剂（如 β-巯基乙醇）的样本缓冲液中，95 ℃ 下加热样本 5 到 10 分钟。这样可以让线性化蛋白带上与其大小成正比的负电荷。将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液，确保孔的顶部被缓冲液覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于靶蛋白的分子量。将分子量标志物上样至第一泳道，然后将样本上样至相邻的孔中。所有样本均含有等量蛋白。所有样本完成上样后，添加电泳缓冲液，给电泳槽盖上盖子。打开电源，按照制造商的推荐设置凝胶槽中凝胶的电压。这时应该能够看到凝胶槽中有上升的气泡。跑胶，直到染料前沿充分移动至凝胶。下一阶段是将蛋白从凝胶转移到膜。膜通常由硝化纤维或 PVDF 制成。从凝胶槽中取出凝胶，并小心地将它从塑料盒中释放。切断孔和凝胶脚，并将凝胶放入转膜缓冲液中。将膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间，制备转膜层。膜应靠近正极，凝胶应靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的气泡。夹住关闭的转膜箱，并将它浸入含有转膜缓冲液的转膜槽中。向外室加水，以保持系统冷却，并盖上盖子。打开电源，开始转移蛋白。时间和电压需要优化，请查看制造商的说明。现在蛋白已经从凝胶转移到硝酸纤维素膜上了，可以用抗体检测目标蛋白了。膜可以从盒中取出，现在应该可以看到分子量标志物了。如有需要，可以用丽春红 S 溶液对膜进行染色，从而确认蛋白质的转移。为了防止抗体发生非特异性结合，需要封闭膜。将封闭缓冲液倒在膜上，并置于摇床上轻轻摇动。通常情况下，需要使用 5% 牛奶或牛血清白蛋白（BSA）溶液在室温下孵育两小时或 4℃ 下孵育过夜。应优化封闭缓冲液的时间和类型，请查看您打算使用的一抗的数据表，了解详细信息。膜封闭后，去除封闭缓冲液，在同一溶液中加入稀释的一抗。与之前一样，置于摇床上孵育。通常会在室温下孵育一抗 1 小时或 4℃ 下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。如需任何指导，请查阅抗体数据表。倒出一抗，用洗涤缓冲液冲洗膜两次。随后在摇床洗涤膜 1 次，时长 15 分钟，再洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。洗涤缓冲液通常是含 0.1% 吐温 20 的 Tris 缓冲盐溶液（TBS）或磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）。倒掉洗涤缓冲液，在偶联二抗中孵育膜，二抗需先在封闭缓冲液中稀释。通常要在室温下孵育一小时，但抗体浓度和孵育时间需要优化。倒掉二抗，并按照上述步骤清洗膜。有几种不同的检测系统。如果二抗与酶偶联，则成像前，应在合适的底物中孵育膜。如果二抗是荧光偶联二抗，可以直接进入成像步骤。成像时使用 X 射线胶片或数字成像系统。将膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带，可能需要优化曝光时间。

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Detection Overview

After transfer, proteins from the gel will be immobilized on the membrane. This section describes the process of specifically detecting your particular protein of interest in order to identify and quantify its presence and abundance in the sample. Western blot detection of proteins utilizes primary antibodies that are specific for the target protein which are then in turn recognized by secondary antibodies that are conjugated with enzymes or fluorescent molecules for detection. The correct selection and use of appropriate primary and secondary antibodies is crucial for maximizing signal while reducing background. The proper use of protein loading controls are also critical for signal normalization in quantitative western blotting. We discuss the most popular methods to detect total protein on the membrane for loading controls and their relative advantages and disadvantages.

The Immunodetection Workflow

Western Blotting Antibody Detection

After proteins are transferred from the gel to the membrane, antibodies specific to your protein of interest (primary antibodies) are incubated with the membrane to allow them to recognize their targets. A second incubation with conjugated antibodies specific to the primary antibodies (secondary antibodies) enables visualization by various methods.

Block unbound membrane sites

Membranes are incubated in a blocking agent that masks any sites on the membrane that would allow antibodies to bind non-specifically. Failure to do so raises background.

Incubate with primary antibody. Wash away excess.

Membranes are then incubated with primary antibodies that are specific to your protein of interest. These bind to their targets and any excess is washed away.

Incubate with secondary antibody. Wash away excess.

The membrane is then incubated with secondary antibodies that recognize the primary antibodies and are also conjugated to either an enzyme or a fluoroscent molecule. Any excess is washed away.

Develop signal

For secondary antibodies conjugated with an enzyme, the membrane is incubated with a chemical substrate that produces a signal that can then be detected. If the secondary is conjugated to a fluorescent label, the membrane can be directly imaged in an instrument capable of fluorescent imaging.

Blocking

Following transfer, unoccupied antibody binding sites on the membranes must be blocked to prevent nonspecific binding. Failure to completely block these sites can lead to high backgrounds that obscure the signal.

Various blocking reagents are available, and no single blocker will be optimal for all antibody/antigen combinations. The best blocker for each experiment will depend on the antibody and membrane type. Optimize the detection system for maximal signal with lowest background by testing several blocking agents. Modern formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer are universal, performing well across a wide range of targets, sample types, and detection methods.

Blocking duration also affects the signal and background levels. Blocking for 1 hour with constant agitation is a good starting point. Excessive blocking times may result in lower sensitivity as epitopes can be masked by the blocking agent and proteins washed off the membrane. In contrast, insufficient incubation times will increase nonspecific binding of the primary antibody. Advanced formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer can complete the blocking step in 5 minutes.

For detection of a phosphorylated form of a protein, blocking buffers should not contain phosphorylated proteins to avoid high background signal. Avoid use of nonfat dry milk and instead use BSA, casein, or advanced formulations that are compatible with phosphoprotein detection.

Quick Tips:

Optimizing the Blocking Step in Western Blotting

Watch the video to understand the experimental parameters and which type of blocking agent to use to ensure success of your western blot.

Agent

Pros

Cons

Non-fat milk (1–5%)

Inexpensive, widely available

Not ideal for phosphoproteins, biotin-avidin/streptavidin, or AP detection

Speckling if not completely solubilized

BSA (0.5–5%)

Recommended for phosphoprotein detection, AP/biotin-avidin detection

Not usable with antibodies created using BSA-coupled peptides, phosphotyrosine Ab

Casein (1–2%)

Balance of stringency & sensitivity

Ideal for most detection methods

Blocking may be insufficient for complex biological samples

Gelatin (1–5%)

Inexpensive, widely available

Fish gelatin does not cross-react with mammalian proteins

Porcine gelatin solidifies in cold blocking

Speckling if not completely solubilized

Cannot be used with avidin-biotin detection

Specialized

Advantage depends on product

Can be expensive

Primary Antibodies

An antibody is an immunoglobulin protein such as lgG that is generated in response to exposure to a foreign substance, or antigen. Antibodies have specific affinity for the antigens that elicited their synthesis.

Primary Antibodies

Primary antibodies are raised against a protein of interest and will selectively recognize and bind to target proteins that have been immobilized to a membrane. Antibodies can be designed to be specific for certain parts of a target protein, or they can be designed to be specific for only modified versions of the protein.

Primary Antibody Selection

Antibodies should be specific, selective, and give reproducible results. To ensure the specificity of the primary antibody, it is important to use positive and negative controls when running your blot. As a positive control, purified proteins or lysates overexpressing the target protein can be used. As a negative control, you can include secondary-antibody-only controls (omitting the primary antibody incubation step) and samples from a tissue or cell lysates known not to express the target protein such as cells engineered with a genetic knockout. Before performing the experiments review the literature in order to understand the expression profile of the protein

Selecting Primary Antibodies for Best Results in Western Blotting

Choosing a Primary Antibody for Multiplex Western Blotting

How to Select the Right Antibody

Bio-Rad has developed tips to consider when choosing your antibody.

See Antibody Tips

The wording good and bad antibody or the most specific antibody should be avoided, since a specific antibody in one sample context can give rise to high cross-reactivity in another sample context depending on the nature of the epitope(s) that it will recognize.

— Edfors et. al. 2018, Nature 9:4130

When selecting a phospho-specific antibody for your experiments, it is crucial to ensure that the antibody specifically detects the protein of interest only when it is phosphorylated at the indicated site. You might also want to consider treating cells with growth factors or chemical compounds that induce or inhibit expression of the target.

Monoclonal vs. Polyclonal Antibodies

The antibodies used to detect the target protein in a western blot will be either monoclonal or polyclonal. Polyclonal antibodies consist of a mixed pool of immunoglobulin molecules that bind to several different epitopes found on a single antigen. Polyclonals are usually produced in rabbits, donkeys, sheep, and goats, and are purified from serum.

In contrast, monoclonal antibodies bind to a single epitope within a target antigen. They are composed of homogeneous cloned immunoglobulin molecules, rather than the heterogeneous antibody mixture typical of polyclonals. Monoclonals are made by fusing antibody-producing cells from the spleen of the immunized animal (usually a rat or mouse) with an immortalized cell line to produce single specificity antibodies that can be purified from tissue culture supernatant.

Monoclonal

Polyclonal

Specificity

Specificity for a single epitope.

Varying specificities to multiple epitopes

Identification

Identifies whether a particular region of a protein is present

Identifies the entire target protein via binding at multiple sites. Since multiple epitopes are targeted, there is a higher likelihood of detection of the target

Cross-Reactivity

May cross-react with other proteins that share this epitope, such as isomers or common motifs

Higher background and cross-reactivity possible due to detection of multiple epitopes, any of which may be shared by related proteins

Sensitivity

Usually less sensitive since only a single antibody molecule binds to each target

More sensitive because signal is amplified through the binding of several antibodies per target

Cost

More expensive to produce initially, but available in an unlimited supply

Less expensive to produce initially, but supply is limited to immunized animal(s). Greater variability between preparations

Primary Antibody Incubation

After blocking, the membrane is incubated in a solution containing the primary antibody, usually diluted in blocking buffer. The time and temperature of incubation depends on the binding affinity of the antibody to the target protein and should be determined for each antibody individually. One hour at room temperature with gentle agitation is a good starting point. In order to reduce the background staining, the amount of Tween 20 used in the buffers is also important.

Antibody Concentration

The optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Instructions for antibodies obtained from a manufacturer typically suggest a starting dilution range. For custom antibodies or for those where a dilution range is not suggested, good starting points are:

1:100–1:1,000 dilution when serum or tissue culture supernatants are the source of the primary antibody

1:500–1:10,000 dilution of chromatographically purified monospecific antibodies

1:1,000–1:100,000 dilution may be used when ascites fluid is the source of antibody

Quick Tips:

How to Optimize Primary Antibody Concentration and Incubation for Western Blots

Watch this video to explore considerations for optimizing incubation time and dilution of primary antibodies when performing a western blot.

See Our Western Blotting Primary Antibodies

Phospho-Specific Antibodies

Protein phosphorylation, the addition of a phosphate group to serine, threonine or tyrosine residues, is an important cellular process utilized to send cellular signals from the membrane to the nucleus. Protein phosphorylation may result in conformational changes that trigger the activation or inactivation of an enzyme.

Phospho-specific antibodies are primary antibodies that detect only the phosphorylated forms of proteins and recognize the phosphorylated serine, threonine, or tyrosine residues in the context of the rest of the protein. Using a combination of total protein detection (using primary antibodies that recognize both phosphorylated and non-phosphorylated forms of the protein) and phospho-specific antibodies, it is possible to assess the degree of phosphorylation for any given protein.

Prior to using phospho-specific antibodies, ensure that the antibodies have been validated for your experimental system. This can be accomplished by using positive and negative controls. For example, lysates from cells that are either untreated or have been treated to stimulate the pathway of interest can act as negative and positive controls. Likewise, absence of detection can act as a negative control on lysates that have been treated with lambda phosphatase to remove phosphate groups.

See Our Phospho-Specific Antibodies

Secondary Antibodies

Purification of Cross-Adsorbed Antibodies

A solution of secondary antibodies raised against mouse lgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.

Only antibodies highly specific for mouse lgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse lgG.

Secondary antibodies are specific for the isotype and species of the primary antibody. For example, a goat anti-rabbit secondary is an antibody raised in goats against a primary antibody raised in rabbits.

Secondary antibodies bind to a number of different conserved regions on the primary antibody, and act to amplify the signal, increasing detection sensitivity. Secondary antibodies are labelled with either an enzyme for colorimetric or chemiluminescent detection or with a fluorescent dye for fluorescent detection of the protein of interest.

Cross-Adsorbed Antibodies

Secondary antibodies raised against primary antibodies of one species can recognize those from other species, especially if they are from closely related animals. For example, parts of the constant regions of mouse and rat antibodies are evolutionarily conserved, leading to conserved epitopes between both species. Since secondary antibodies are generally polyclonal, when generating secondaries against mouse, a subset of those secondaries will be specific for those conserved epitopes, being able to recognize them whether the epitope resides on a mouse or rat antibody. This cross-reactivity could lead to unexpected bands when multiplexing or cause high background.

To remove the undesired antibodies from a polyclonal pool, an affinity chromatography column is used to purify the secondary antibody preparation of offending cross-reactive species. Clonal antibodies that recognize the immobilized antigen(s) are removed. The unbound pool of antibodies is now cross-adsorbed against the immobilized antigen and should show no reactivity towards it.

The most common type of cross-adsorbed secondary antibody is species specific, which is most useful for multiplexing, although there are also instances when isotype-specific antibodies are required. For example, immunization with a purified IgG1 preparation might be expected to generate a serum with a specific reactivity towards IgG1 and no cross-reactivity with other antibody isotypes. However, due to the polyclonal nature of the serum combined with the conservation of some epitopes between classes and isotypes, a component of the polyclonal serum may react with an epitope on IgG1 that is also found on IgG2a, confounding the isotype specificity.

A solution of secondary antibodies raised against mouse IgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.

Only antibodies highly specific for mouse IgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse IgG.

Secondary Antibody Concentration

Similar to primary antibodies, the optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Fortunately, high-quality secondary antibodies are commonly available, and manufacturers typically suggest a starting dilution range.

See Our Western Blotting Secondary Antibodies

Quick Tips: How to Choose Secondary Antibodies for Multiplex Western Blotting

In this video, we discuss the best practices for selecting secondary antibodies that are compatible with your primary antibodies and your detection methods to produce high-quality, reproducible results.

Detection Methods

In the past, many different methods were used for western blot detection, but now the vast majority employ enzymatic chemiluminescence or fluorescent detection. Thus, most secondary antibodies are conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) for use with a chemiluminescent substrate or labeled with a fluorescent compound for imaging.

Chemiluminescence Detection

Chemiluminescence is a chemical reaction in which the oxidation of a chemical substrate such as luminol is catalyzed by an enzyme, typically horseradish peroxidase (HRP), and the reaction produces light as a byproduct. The resulting light can be captured on film or by a digital imager.

Luminol emits light only weakly, so enhancers are added to the reaction to increase the signal. This enhancement of a luminol-based signal is commonly referred to as enhanced chemiluminescence (ECL). There are a number of different enhancers available, some of which can increase the signal by as much as a 1,000-fold, making ECL more sensitive than other common detection systems such as conversion of substrates to colored precipitates.

The light intensity will be roughly proportional to the quantity of your protein of interest, allowing semi-quantitation of relative protein abundance. Since this detection method relies on an enzyme-substrate interaction, the kinetics of the reaction plays a role in the linearity of the signal. Therefore, for more accurate quantitation, care must be taken to ensure that the sample load is within the linear range of the assay and the detection signal is not saturated.

Luminol oxidized by HRP in the presence of H2O2 leads to the formation of a 3-aminophthalate dianion and the release of light.

Quick Tips:

How to Image a Chemiluminescent Western Blot

Watch this video to see how to prepare a western blot membrane for chemiluminescent detection and ensure a strong chemifluorescent signal during image acquisition.

See Our Chemiluminescent Substrates »

Fluorescence Detection

In fluorescence detection, a primary or secondary antibody is labeled with a fluorescent molecule (a dye or fluorophore). A light source that produces photons within the fluorophore's excitation spectrum excites the fluorophore, and the fluorophore then emits photons with a longer wavelength. The difference in wavelength between excitation and emitted light is termed Stokes shift. This emitted light of longer wavelength can then be distinguished from the excitation light via appropriately designed optical filters and detected by a digital imager.

Fluorescence detection has a number of advantages over traditional chemiluminescent detection. As fluorescent detection does not rely on an enzyme-substrate reaction, the use of fluorophores can be more quantitative than chemiluminescent detection, is often faster, and reduces waste.

The greatest advantage of fluorescent western blotting detection over chemiluminescent detection is the ability to simultaneously detect a large number of proteins on one blot, using a process called multiplexing. This relies on choosing fluorophores that fluoresce at different wavelengths and can be distinguished by the digital imager.

Fluorophore Selection

When using fluorescence detection, consider the following optical characteristics of the fluorophores to optimize the signal:

Quantum yield — efficiency of photon emission after absorption of a photon. Processes that return the fluorophore to the ground state but do not result in the emission of a fluorescence photon lower the quantum yield. Fluorophores with higher quantum yields are generally brighter.

Extinction coefficient — measurement of how well a fluorophore absorbs light at a specific wavelength. Since absorbance depends on path length and concentration (Beer's Law), the extinction coefficient is usually expressed in cm -1 M-1. As with quantum yield, fluorophores with higher extinction coefficients are usually brighter.

Stokes shift — the difference in the maximum excitation and emission wavelengths of a fluorophore. Since some energy is dissipated while the fluorophore is in the excited state, emitted photons are of lower energy (longer wavelength) than the light used for excitation. Larger Stokes shifts minimize overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detected signal.

Excitation and emission spectra — excitation spectra are plots of the fluorescence intensity of a fluorophore over the range of excitation wavelengths; emission spectra show the emission wavelengths of the fluorescing molecule. Choose fluorophores that can be excited by the light source in the imager and that have emission spectra that can be captured by the instrument. When performing multiplex western blots, choose fluorophores with widely separated emission spectra to enable good signal separation among the different color channels.

Fluorophore Stokes Shift

A high-energy photon excites a fluorophore, causing it to leave the ground state (S0) and enter a higher energy state (S11). Some of this energy dissipates, allowing the fluorophore to enter a relaxed excited state (S1). When the fluorophore returns to the ground state, a photon of light is emitted. Since some of the energy was dissipated, the emitted photon is of lower energy (longer wavelength).

The difference in wavelength between the exciting light and the emitted light is called the Stokes shift. Larger Stokes shifts minimize the overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detection signal-to-noise ratio.

See Our Products for Fluorescent Western Blotting Detection »

Total Protein Detection

Total protein staining provides an image of the complete protein pattern on the blot. This information helps determine transfer efficiency and molecular weight of the transferred proteins. This information can also be used to determine relative quantity of sample that was loaded in each lane.

Several total protein stains are available and commonly used in western blotting. The table below provides an overview of total protein detection methods and applications.

Total Protein Detection Methods for Western Blotting

Detection Method

Sensitivity

Advantages

Disadvantages

Imaging

Anionic dyes (Ponceau S, Fast Green, Coomassie Brilliant Blue, Amido black)

100–1,000 ng

Inexpensive, rapid

Coomassie and Amido black are not compatible with downstream immunodetection

Epi illumination

Fluorescent stains (SYPRO Ruby and Deep Purple)

2–8 ng

Sensitive; most are compatible with immunodetection

Additional staining and destaining steps

Fluorescent capable digital imager with UV, visible light LED, or lasers

Stain-Free Imaging

2–28 ng

Rapid and convenient—ready in less than one minute, and no separate staining or destaining required. Sensitivity comparable to Coomassie

Requires use of Stain-Free Gels and compatible imager

Bio-Rad imagers

Stain-Free Imaging Technology

Bio-Rad's stain-free technology allows direct visualization, analysis, and documentation of protein samples in PAGE gels and on blots, without staining or destaining. Stain-free imaging provides equal or better sensitivity compared to Coomassie staining and eliminates organic waste disposal concerns.

Linear dynamic range provided by stain-free technology for total protein measurements. HeLa cell lysate dilutions from 80–2.5 µg total protein.

Learn More about Stain-Free Imaging Technology »

Total Protein Normalization

Bio-Rad’s stain-free technology can be used for total protein normalization of western blots. Total protein normalization uses the signal of all proteins in a sample to determine load. This approach is more robust against expression changes of any one protein to an experimental condition, which can occur when using a single “housekeeping” protein.

Learn More about Total Protein Normalization »

Immunodetection Tips and Protocols

Western Detection Tips

Use high-quality primary antibodies.

A good antibody is sensitive, meaning it can detect low amounts of your target, and is also specific, recognizing only the target, without giving spurious secondary bands. Antibody vendors are increasingly offering antibodies that have been certified for western blotting.

Use cross-adsorbed secondary antibodies.

Cross-adsorbed antibodies offer a lower chance of cross-reactivity and reduced background giving more reliable results. They are readily commercially available so they should be used whenever possible.

Optimize antibody concentration to maximize signal to background.

Sensitive detection of your target depends on high signal and low background. Reducing antibody concentration can reduce desired signal, but the greater reduction of background more than makes up for this.

For multiplex detection, first optimize antibodies to targets individually.

When detecting multiple targets simultaneously, carry out detection of each target individually first. This will simplify any needed troubleshooting.

Western Detection Protocols and Resources

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Western Blotting Protocol Library​

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Stain-Free Western Blotting Guide

Find out how Stain-Free technology can revolutionize your western blotting.

Better Western Blotting Guide

Tips, Techniques, and Technologies from the Western Blotting Experts at Bio-Rad Laboratories.

Protein Blotting Guide

(PDF 7.2 MB)

Details on blotting technology, methods, products, tips, techniques, and troubleshooting guidelines.

Western Blot Doctor

Our self-help troubleshooting guide covers solutions to many common and not-so-common western blotting issues and helps your blots look their best.

Best Practice for Western Blot Detection of Phosphorylation Events

Ten tips to ensure robust data generation and cleaner blots.

Protocol: Detection of Phosphorylated Proteins by Western Blotting

This protocol describes how to detect phosphorylated proteins by western blotting using Phospho-Specific PrecisionAb Antibodies.

Fundamentals of Western Blotting Course #3: Immunodetection​

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